Biology/분자생물학

분자생물학개론 | Cloning Vectors for Organisms Other than E. coli

곰뚱 2019. 11. 12.

TIP

1. Vectors for Yeast and Other Fungi
2. Cloning Vectors for Higher Plants
3. Cloning Vectors for Animal Cells

대부분의 cloning 실험은 숙주로서 E. coli 와 함께 수행되며, 매우 다양한 cloning vector 들이 이 생물체에 대해 유용하다. Cloning 실험의 목적이 유전자 구조와 기능 같은 분자생물학적인 기본적 특징을 연구할 때 특히 그렇다. 그러나 어떤 경우에는 gene cloning 실험을 위해 다른 숙주를 이용하는 것이 바람직할 수도 있다.

이것은 그 목적이 유전자 연구가 아니라 중요한 대사산물(ex, hormone)의 합성을 조절하거나 향상시키고, 또는 생물체의 특징을 변화시키는(ex, 제초제 저항성 농작물에 도입시키는 등) cloning 기법을 사용하는 생물공학분야에서 특히 그렇다. 따라서 E. coli 이외의 다른 생물체를 위한 cloning vector를 생각해야 한다.

Vectors for Yeast and Other Fungi

Yeast Saccharomyces cerevisiae는 생물공학에서 가장 중요한 생물체 중 하나이다. Yeast는 양조와 제빵에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 조작된 유전자로부터 중요한 의약품을 생산하기 위한 숙주생물체로서 이용되고 있다. Yeast를 위한 cloning vector 들의 개발은 S. cerevisiae의 대부분 균주에 존재하는 plasmid인 2㎛ circle의 발견에 의해 자극되었다.

(1) Selectable markers for the 2㎛ plasmid

2㎛ circle은 크기가 6kb이고 yeast cell내에서 copy number는 70~200 사이이다. 복제는 plasmid origin을 이용하고, 복제를 위해 필요한 효소는 plasmid의 REP1, REP2 에 암호화되어 있는 단백질, 그리고 일부는 숙주세포로부터 공급받는다. 따라서 2㎛ circle은 cloning vector로서 이상적이다.

그러나 2㎛ circle 이 cloning vector로서 완벽한 것은 아니다. 우선 selectable marker가 없다. 최근의 yeast cloning vector들은 methotrexate와 copper 같은 저해제에 대해 저항성을 부여하는 유전자를 가지고 있는 것이 있긴 하지만, 대부분은 아미노산 생합성과 관련된 효소를 암호화하고 있는 yeast gene이 이용된다. 일례로 pyruvate를 leucine으로 변환시키는 효소들 중 하나인 β-isopropyl malate dehydrogenase를 암호화하고 있는 LEU2 유전자를 이용한다.

Selectable marker로써 LEU2 를 이용하기 위해선, 숙주생물이 non-functional LEU2 유전자를 가진 돌연변이체 이어야만 한다. 그러한 leu2 - yeast는 leucine을 합성할 수 없고 따라서 성장배지에 leucine이 공급되는 경우에만 생존할 수 있다. Cloning 실험에서, 세포는 최소배지(추가된 아미노산이 없는)에 plating 된다. 형질전환된 세포만이 생존할 수 있고 colony를 형성할 수 있다.

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(2) Vectors based on the 2㎛ circle -yeast episomal plasmids

2㎛ circle로부터 유도된 vector를 yeast episomal plasmid 또는 YEp 이라 부른다. 일부 YEp은 완전한 2㎛ circle을 가지고 있고, 나머지는 단지 2㎛ 의 replication origin 만을 포함하고 있다.

Shuttle vector를 사용하는 이유는 형질전환된 yeast colony로부터 재조합 DNA분자를 회수하기 어려울 수도 있기 때문이다. 이러한 문제는 yeast vector가 yeast chromosome 내부로 통합되는 경우 발생하며, 이 경우 재조합 DNA분자의 순수분리는 불가능하다. 따라서 yeast에서 cloning 실험을 할 때, 표준적인 실험방법은 처음에 cloning 실험을 E. coli 와 함께 수행하여 recombinant를 선별하고 난 후, recombinant plasmid를 분리하여 특징을 결정하고, yeast 내부로 그 correct molecule을 도입시키는 것이다.