Biology/분자생물학

분자생물학개론 | Studying Gene Location and Structure

곰뚱 2019. 11. 25.

TIP

1. How to study the location of a cloned gene
2. DNA sequencing - working out the structure of a gene
3. Using cloned genes to study genome structure

Cloning 실험은 원하는 유전자를 지닌 재조합 DNA분자의 복사본들을 가지고 있는 colony나 plaque를 제공한다. 많은 경우에 있어서, 연구계획에서 다음 단계는 그 재조합 DNA분자를 정제하여, 조작된 유전자에 대해 가능한 많은 정보를 얻는 것이다. 예를 들면 Plasmid와 같은 작은 DNA molecule 또는 chromosome과 같이 큰 DNA molecule에서의 유전자 위치를 알아내는 여러 방법이 있다. 이를 위한 적절한 방법들은 세 가지 범주로 나누어진다.

How to study the location of a cloned gene

(1) Locating the position of a cloned gene on a small DNA molecule

R6-5의 kanamycin 저항성 유전자를 pBR322의 EcoRI site 내부로 삽입시키는, 이전 chapter에서 사용된 예를 생각해 보자. R6-5는 13개의 EcoRI site를 가지고 있기 때문에 그 유전자는 13개의 EcoRI 단편들 중 하나에 존재할 것이다. 이러한 정보는 R6-5 restriction map에서 그 유전자의 위치와 나머지 유전자들의 상대적인 위치를 결정할 수 있도록 하였다.

EcoRI으로 절단된 R6-5 의 각 단편들을 볼 수 있도록 하기 위해 agarose gel에서 전기영동 시킨다. 이들 단편들 중 하나는 재조합 pBR322에 삽입된 것과 같을 것이다. 따라서 재조합 분자를 표지시켜서 그 유전자를 가진 단편을 찾기 위해 이용한다. 이것은 그 단편들이 전기영동 gel내에 아직 있는 상태에서 시도될 수 있지만 그 결과는 대개 매우 좋지 않다. 따라서 그 대신 agarose gel상의 DNA band를 nitrocellulose 나 nylon membrane으로 이동시킨다.

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Agarose gel로부터 membrane으로 DNA band의 이동은 1975년에 E.M. Southern교수에 의해 완성된 기술을 이용하며, 이 기술을 Southern transfer라고 부른다. 이와 동일한 방법은 또한 RNA분자(northern transfer)나 단백질(western transfer)의 이동을 위해 이용될 수 있다.

Southern transfer의 결과, membrane은 DNA band의 replica를 가지게 된다. 표지된 probe가 지금 적용된다면, 혼성화가 일어날 것이고 autoradiography(또는 non-radioactive probe를 이용한 방법)에 의해, 조작된 유전자를 가진 단편을 확인할 수 있을 것이다. 그런 후에는 R6-5 restriction map상에 kanamycin 저항성 유전자의 위치를 결정할 수 있을 것이다.

Southern hybridization은 또한, 재조합 DNA분자내에 조작된 유전자의 정확한 위치를 결정하기 위해 이용될 수도 있다. 이것은 조작된 DNA단편이 비교적 거대할 수 있기 때문에 중요하다. 또한 조작된 단편은 추가적으로 수많은 유전자들을 가지고 있을 수도 있다.