반응형 생명과학실험 | RNA interference 기법을 이용한 유전자 발현 억제 TIP 1. 유전자의 기능을 연구하기 위한 가장 효과적인 방법인 유전자를 유전체(genome)로부터 제거한 뒤 관찰하는 것을 가능하게 하기 위해서 small interfering RNA를 이용하여 유전자의 발현을 억제시키는 방법을 배워본다. 2. 본 실험에서는 cell을 눈으로 볼 수 있도록 H2AX 단백질에 GFP 형광 단백질을 넣어주어 형광 단백질의 %를 이용하여 쉽게 관찰할 수 있도록 한다. RNA interference RNA가 이중나선 형태를 지니고 있을 때 나타나는 현상으로 이중나선 RNA가 mRNA를 분해하여 특정 유전자를 발현되지 못하게 하는 것을 의미한다. 즉, central dogma 를 일으키지 못하게 하는 것이다. 이중가닥 RNA는 다이서(Dicer)라는 단백질에 의해 인식되어 작은.. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 11. 18. 생명과학실험 | Immunoprecipitation Immunoprecippitation(면역침강법) 특정 단백질의 존재를 확인하기 위해 그 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 결합 시키는 방법이다. 이때 보통은 antigen-antibody 만을 넣어 특이적 결합을 시킨다 하여도 그걸 눈으로 확인할 방법이 없으니 그것을 위해 무거운 bead를 넣어 침전물이 발생하게 만든다. 이런 Immunoprecippitation의 방법에는 Individual protein immunoprecipitation (IP), Protein complex immunoprecipitation (Co-IP), Chromatin immunoprecipitation (ChIP), RNA immunoprecipitation (RIP) 등의 방법이 있으나 Chromatin i.. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 11. 14. 생명과학실험 | Enzyme-linked immunosorbent assay TIP 실험을 통해서 어떻게 ELISA가 작용하는지 알아 보자. 또한 specific protein-protein interaction을 이해해 보자. Enzyme-linked immunoassay (ELISA, 효소결합면역흡착검사) antibody를 이용하여 색깔의 변화를 관찰하고 그 결과를 통하여 antigen이 sample내에 존재하는지를 판별하는 실험법이다. 이 실험 법은 indirect ELISA, direct ELISA, sandwich ELISA 이렇게 3가지 종류가 있다. 이제 이 세가지 실험법들이 어떻게 다른지에 대하여 알아보자. ELISA의 보편적인 실험 원리는 다음과 같다. Protein이 잘 흡착되는 well의 바닥에 알아보고자 하는 antigen이 들어 있는 sample을 넣고 흡.. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 11. 10. 생명과학실험 | Specific activity and enzyme kinetics of alkaline phosphatase TIP 효소의 활성도를 흡광도를 이용하여 측정하는 방법과, specific activity의 개념을 이해하고, enzyme kinetics에서 기본이 되는 M-M equation과 Linear-burk equation을 이용행서 효소활성의 척도가 되는 Km,Vmax,kcat 등을 실험적으로 측정한다. Specific activity of Enzyme 단위 질량 당 효소의 활성을 말하며, 효소활성을 단백질의 단위중량당으로 나타낸 것. 일반적으로 활성의 단위는 비〔U/㎎〕로 나타낸다. 효소 이외의 불순한 단백질이 적을수록 비활성이 높아지기 때문에 효소정제의 척도가 된다. 효소의 정제 순도가 높을수록 specific activity가 증가한다. 실험 방법 1. Bradford assay (단백질 정량) 1) .. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 11. 6. 생명과학실험 | Western blot analysis TIP 1. 항원에 대한 항체의 특이적 결합을 이용하여 protein 혼합물로부터 어떤 특정 protein을 분석하는 Western blot의 원리를 이해한다. 2. protein의 SDS-PAGE분리, protein의 gel로부터 membrane으로의 transfer, 항체반응 및 항체에 부착된 효소의 반응에 의한 발색반응 등의 실험기법을 습득한다. Western blot 정제를 할 때에는 이온 교환 형식만 가지고는 완벽하게 정제하기가 불가능 하다. 그래서 SDS-PAGE로 여러 protein이 섞인 것을 확인할 수 있다. 이제 그 안에 존재하는 protein 중에 어느 protein이 진짜 원하는 AP를 포함하고 있는지 확인해 보는데 이때 사용할 것이 Western blot이다. Western blo.. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 10. 31. 생명과학실험 | SDS PAGE gel 제조 & Gel Loading & Coomassie Brilliant Blue Staining TIP 단백질을 SDS urea나 2-mercapto ethanol과 같은 환원제로 용해시킨 후, SDS로 (-)전하를 띄게 하여 size별로 분리 해 보자. SDS-PAGE Gel 제조시 각 materials의 역할 Buffer의 선택은 gel의 resolution에 영향을 준다. Buffer는 반응을 하지 말아야 하고, 대부분의 protein과도 반응을 하거나 protein을 변화시켜도 안된다. 이때 Tris-HCl buffer는 이러한 성질을 가장 잘 갖추고 있는 buffer이다. 또한 Tris-HCl buffer는 pH값을 원하는 값으로 안정 시켜 준다. 그 다음으로 알아 볼 buffer는 acrylamide이다. 이 buffer는 물에서 vinyl addition polymerization이라는.. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 10. 24. 생명과학실험 | Alkaline phosphatase의 정제 TIP Ion-exchange chromatography에 의한 단백질 정제 원리를 이해하고, DEAE anion exchange column을 이용한 AP 단백질의 정제기법을 습득하게 된다. Alkaline Phosphatase(AP) Phosphatase는 인산화 되어 있는 분자에서 인산기를 제거하는 효소이다. 대개 생체내의 효소는 특정한 기질과만 반응하는 기질 특이성을 지니는데, AP같은 경우에는 특정한 기질과만 반응하지 않는 nonspecific phosphatase에 해당한다. 이름에 alkaline이 붙는 이유는 이 효소가 작용할 수 있는 최적의 환경이 염기성이기 때문이다. AP는 보통 homo-dimer로 작용하며 크기는 140-160 kDa정도이다. (-)charge를 띠며, 75～85℃의.. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 10. 9. 이전 1 2 3 다음 반응형
