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  보건환경미생물학실험 | Observation of the expressed protein via SDS-PAGE TIP SDS-PAGE를 통해서 미생물이 발현한 단백질을 크기로서 구분해내고자 한다. 2-D electrophoresis 후에 그 튜브는 수직판 겔의 윗부분과 수평적으로 위치하고 단백질의 그 튜브 밖으로 나와서 크기에 따라 분리되는 젤로 이동한다. 그것이 2-D gel이며, SDS가 사용되고, 계면활성제는 단백질의 소수성 부위에 붙어 모두 음전하를 만든다. 단백질은 같은 전하이므로 전하보다는 M.W.에 의해 분석된다. 음전하를 띠는 단백질은 양전하 쪽으로 이동한다. 실험 방법 1. IPTG Induction 1) pPSC1(pPROEX-1 + pnrB)가 도입되어 있는 E. coli BL21을 LB에서 37℃ overnight로 배양한다. 2) 계대배양으로 pPSC1 : LB를 1:100 또는 1:50으.. Engineering/환경 | 토양 | 폐기물처리 공학 2022. 10. 11.

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  생화학실험 | RNA 추출 & cDNA 합성 TIP 세포에서 직접 RNA를 추출하여 보고, 추출된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하여 RT-PCR을 통해 특정 유전자의 mRNA 발현량을 비교한다. Chloroform의 역할 RNA extraction을 할 때 페놀계열 lysis buffer를 쓰게 되는데, 이후 chloroform을 넣어줌으로써 RNA가 녹아있는 수층의 페놀을 제거하여 RNA의 순도를 높여준다. pH4 정도로 낮을 때 RNA는 물과 함께 섞여있으므로 물에 남아있을 수 있는 페놀을 chloroform에 녹아들게끔 해주는 것이다. 또한 chloroform은 비극성용매여서 물에 잘 녹지 않으므로 층분리가 이루어지게 된다. 실험 방법 1. RNA extraction 1) 500㎕ RiboEx를 넣은 sample에 chloroform 10.. Biology/생화학 2022. 9. 4.

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  분자생물학실험 | Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction(qRT-PCR) TIP 추출된 RNA로 합성한 cDNA를 이용하여 RT-PCR을 진행하고, 특정 유전자의 mRNA 발현량을 비교하여 sample을 평가한다. Housekeeping gene의 이용 housekeeping gene이란 세포에서 높은 수준으로 항상 발현되어 유지되는, 세포 생명활동에 필수적인 기능을 수행하는 유전자의 총칭이다. 외부 자극에 의해 발현이 크게 변하지 않는 특성이 있으며 대표적으로 액틴 단백질, 리보솜 단백질, GAPDH(Glyceraldehyde –3-phosphate dehydrogenase) 등이 있다. housekeeping gene은 높은 수준으로 발현되는, 즉 실험에서 넣어준 만큼 발현되기 때문에 PCR에서 특정 유전자의 전사 발현을 양적으로 비교할 때 대조군과 실험군에서 총 RNA .. Biology/분자생물학 2021. 11. 21.

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  일반생물학실험 | Expression of recombinant α-synuclein gene 실험 방법 1. 실험 과정 1) BL21의 transformation을 시행한 후 배양시킨 배지로부터 E.coli colony를 따서 LB+Amp liquid Media 25㎖에 접종하여 suspension culture를 했다. overnight culture를 한 후 LB+Amp liquid media 325㎖에 부었다. OD를 측정하기 위해서는 처음에 박테리아가 없는 것을 0으로 잡고 우리가 접종하여 키우던 것을 큐벳에 넣고 흡광도를 측정하면 된다. 2) 처음에 OD가 0.1이었고 2시간 후 0.2였다. 37℃에서 좀 더 culture하여 1시간 후 OD가 0.6가 되었다. 이 때 1mM의 IPTG 350㎕(1mM)를 넣은 후 15℃에서 8시간 동안 induction을 시킨다. 이 과정에서 IPTG.. Biology/일반 | 세포 생물학 2021. 10. 7.

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  일반생물학실험 | Transformation - 미생물에서 재조합 단백질 발현 TIP  E.coli의 transformation 실험을 통해서 유전 공학에 많이 쓰이는 transformation의 기작을 이해하고, 그 방법을 익힌다.   형질전환(TRANSFORMATION)형질전환이란 수용세포에 노출된 DNA가 흡수, 통합, 발현되는 과정을 나타내며 몇몇의 박테리아 사이에서 자연적으로 일어나는 현상이다 (예로 Stretococcus와 Bacillus). 대장균을 포함한 다른 종은 외부DNA를 흡수할 능력이 없다. 이러한 한계점을 극복하기 위해서 수용세포로 DNA를 삽입하기 위한 인공적인 방법이 고안되었고 수많은 실험생물에 적용되었다. 움직이게 할 수 있는 DNA의 2번째 방법인 형질전환은 1928년 Fred Griffith에 의해 발견되었다.  형질전환은 유전자 형태에서 수용성 C.. Biology/일반 | 세포 생물학 2021. 7. 20.

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  분자생물학실험 | 재조합 단백질 Taq DNA polymerase 발현, 정제 및 확인 실험 방법 1. 재조합 단백질 Taq DNA polymerase 발현 Ampicillin 배지 뒷면에 cell 이름, streaking한 날짜, 본인 이름 등을 써주고 여기에 streaking을 할 Cell stock을 얼음에 가져온다. 팁 끝을 살짝 알코올램프에 대어 주고 식힌 뒤 cell stock을 조금 묻혀 배지에 streaking 한다. 37℃ incubator에 streaking한 LB plate를 뒤집어 넣어 하루간 키운다. 그 다음날 plate를 꺼내 inoc㎕ation과정을 거쳐준다. 먼저 Conical tube에 라벨링을 해주고 (LB AMP 50㎖) LB 50㎖에 맞춰 항생제를 50㎍/㎖가 되게 넣고 위 아래로 흔든다. 그리고 유리실험관에 LB를 6㎖씩 분주해 줍니다. (총 4개) 하.. Biology/분자생물학 2021. 3. 8.

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  생화학실험 | ICC(Immunocytochemistry) TIP 1. 단백질이 어디에서 발현되는 가의 여부를 알 수있고 또한 그 단백질이 어디로 이동하는 가에 대한 것도 볼 수 있다. 2. 살아있는 세포와 cell line 이 2가지를 이용해서 관찰할 수 있으며 서로 장단점이 있다. 각 단백질에 달라붙은 first antibody와 또 그 antibody에 붙는 secondary 형광 antibody에 붙이면 일정 파장을 반사하여 색깔이 보이는 것이다. 실험 결과 실험1. 세포의 모양이 동그란 부분은 왜 그럴까?？ A, B는 세포 분열 중기 과정입니다. A-B 순으로 세포 분열이 일어나는 거죠. C의 경우 대부분 분열과정에 포함시켜 해석하였는데, 사실은 세포 사멸 중입니다. 세포 사멸을 배웠는지 모르겠지만, 세포 사멸 중 특히 Apoptosis 에서는 Nucl.. Biology/생화학 2020. 2. 26.

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  유전공학실험 | PCR과 Transformation TIP 유전자를 cloning하여 vector에 주입하여본다. 그리고, 대장균에 주입하여 발현 정도를 관찰한다. PCR DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술이다. 이 기술은 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또한 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있기 때문에, PCR과 여기서 파생한 여러가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있다. 1970년대에 gene cloning기술의 개발은 이전에 불가능했던 방법으로 유전자와 유전자 활성에 대한 연구.. Biology/유전학 2019. 12. 11.

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  생명과학실험 | Alexa 594(Tuj1)의 neural tube(신경관)에서의 발현 TIP 1. 항원-항체반응을 통해 내가 원하는 단백질이 어느 세포에서 나오는지, 어느 정도 얼마큼 나오는지 알아 볼 수 있다. 2. antigen-antibody reaction을 이용하여 Alexa 594(Tuj1)이 neural tube(신경관)의 어느 곳에서 발현하는지 알아보자. 면역조직화학법의 종류 면역조직화학적 검사방법은 직접법 (Direct Method) 과 간접법 (Indirect Method)으로 크게 구분할 수 있으며, 간접법은 표지물질을 결합시킨 항체를 사용하는 표지 항체법 (Lable Conjugate Antibody Method)과 비표지 항체법 (Unlabelled Antibody Method)으로 구분된다. 간접법 가운데 가장 간단한 표지항체법은 일차항체에는 효소를 부착하지 않고.. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 12. 9.

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  생명과학실험 | Antigen-antibody reaction을 통한 protein expression TIP Antigen-antibody reaction을 통하여 protein이 cell 내의 어느 곳에서 발현하는지 알아보자. 면역조직화학법의 원리 면역조직화학적 검사를 이용하여 검출하는 항원은 분자량이 5,000정도인 단백, 다당류, 핵산 등의 고분자 물질이다. 항원에는 항체를 식별하는 특정한 부위가 있는데, 이를 항원 결정부위 (epitope) 라고 부르며 분자량 5,000에 대하여 한군데가 있는 것으로 알려져 있다. 즉, 분자량 이 20,000이면 4개 정도의 항원 결정부위가 있다. 항원에 결합하는 항체는 혈청내의 면역글로블린 (Immunoglobulin, Ig) 이라 부르는 단백질에 존재한다. 면역조직화학에 이용되는 일차항체는 IgG 분자이며 항원과의 결합부위를 갖는 Fab(antigen bind.. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 12. 5.