Ⅰ. 신약 후보물질의 발굴
신약 후보물질의 발굴을 위해서는 우선 질환의 표적이 되는 target을 선정하고, target의 질병과의 관련성을 명확하게 규명하는 target validation 과정과 목표의약품의 특성을 설정하는 TPP를 작성하고 동시에 신약 후보물질의 발굴을 시작하게 된다. 신약후보물질의 발굴은 chemical library를 이용하여 hit 화합물을 도출하거나, 컴퓨터를 이용한 virtual screening 및 CADD (Computer Aided Drug Design) 방법으로 hit 화합물을 발굴 한다. 또는 천연물의 추출 및 생물학적 생산을 통하여 target에 작용하는 hit 화합물을 얻는다. 얻어진 물질의 in vitro 효력, 독성, ADME 스크리닝, in vivo 효력시험 등의 결과를 바탕으로 hit 화합물의 최적화 과정을 통하여 lead 화합물을 발굴하고 다시 최적화 과정을 통하여 신약으로서의 요건을 갖춘 후보물질(candidate)을 도출하고 확정한다
II. Target 선정
의약품 발굴 및 개발을 위해서는 우선 어떠한 질병에 대한 의약품을 개발할 것인지를 시장조사(needs), 경쟁사 분석, 자사의 경쟁력 분석, marketing 방안, licensing potential 분석, 미래예측 등을 통하여 선택한다. 질병이 선정되면 그 질병에 대한 모델을 탐색하고 규명하여 질병과 관련되어 있는 생물학적 표적 (타겟)을 발굴하거나 선택하게 된다.
일반적으로 질병은 여러 가지 원인이 개별적으로 혹은 복합적으로 작용하여 발생되므로, 특정 원인을 제거하여도 치유되거나 경감되지 않는 경우도 많다. 또한, 하나의 원인을 없애기 위해서도 다양한 기전적 접근이 가능한데, 기전조사와 기전개념을 확립하고 최적의 target 기전을 선정한다.
신약개발과정에서 타겟 규명 (target identification)이란 특정 질환의 진행에 있어 명백한 역할을 하는 분자 (타겟)를 찾아내는 것을 말한다. 좁은 의미의 타겟 규명 또는 화학유전체학에서의 타겟의 규명은 생리활성을 가지는 저분자 화합물의 작용점을 규명하는 것이다. 이들 target 으로는 특정 효소 (enzymes), 각종 수용체들 (receptors) 또는 이온채널 (ion channels) 등이 대상이 될 수 있으며 연구자들은 이 타겟들이 질병의 발병과정 (pathological process)와 연결되어 있음을 확인하게 된다. 신약타겟의 발굴은 분자 또는 세포수준에서 생명현상의 원리를 규명함으로써 바이오 의약 타겟을 발굴하는 연구를 말함이며, 세포 및 분자수준 실험 등을 통한 약물 기전 연구와 발굴된 신약타겟을 제어할 수 있는 방법 개발에 필요한 기반기술 연구를 포함한다.
또한 분자타겟에 관련된 특정 단백질의 발현 정도가 정상인 상태와 비교하여 높거나 낮은 현상을 확인하여 특정 단백질의 발현을 제어하는 SiRNA 를 이용하여 특정단백질의 발현정도를 제어하여 질병과 타겟의 연관성을 파악하는 연구를 수행한다. 최근에는 생체 신호/활성 및 생체 분자 구조에 기반한 연구를 통하여 각종 질환의 신약 타겟을 발굴한다. 특히, 각종 단백질의 신호 네트워크를 중심으로 세포신호와 유전자 발현 조절연구, 이들 생체 기능체계를 기반으로 하는 타겟을 도출한다.
III. 목표 의약품의 특성 (Target product profile, TPP)
TPP 는 FDA guidance 로 2007 년 3 월에 발행되어 알려져 있다. FDA 에 의하면 TPP의 목적은 개발자와 허가를 위한 검토자에게 정확한 정보를 제공하는 것이며, labeling과 관련되어 의약품 개발프로그램을 요약한 내용이다. 또 개발자에 의해 작성되며, 허가자와의 원활한 의사소통을 위한 것이며 제출은 의무사항은 아니다. 과거의 신약개발과정은 연구단계와 전임상, 임상 단계가 서로 유기적인 협력체계를 갖추지 못한 상태에서 각각 연구를 진행하고 다음 단계로 진행하는 경우가 많았다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 clinical target product profile 을 정하고 정해진 목표를 달성하기 위한 각 단계에서 수행할 계획을 수립하고 있다. TPP 문서는 약물개발과정에서 지속적으로 갱신하여야 하고, 신약개발자는 현재 상태가 요구되는 목표에 부합되는지를 정기적으로 검토하여야 한다. 안전성이 우려되거나 새로운 물질이 TPP 기준에 충족되지 못할 경우에는 이러한 문제가 프로젝트의 성공에 미치는 영향을 평가하여야 한다.
다국적 제약사의 의약품 개발의 최종목표는 품목허가를 얻어 임상에서 처방되는 것이다. 목표의약품의 특성(TPP)은 시장에서 요구되는 신약의 특성, 개발의 핵심단계, 성공의 척도 등을 나타내는데 유용하다. TPP 를 명확히 정의함으로써 임상에서의 사용, 임상시험의 설계 뿐 아니라 전임상개발의 전체적인 체계를 구축할 수 있다.
IV. 타겟검증 (Target validation)
타겟 단백질이 질병과정에 관여되어 있음을 입증하는 것을 말한다. 잠정 타겟을 선택한 후에는 연구자는 반드시 이 타겟이 질병과 관련되어 있고 약에 의해 작용하여 치료효과를 나타낸다는 것을 밝혀야 한다. 타겟검증은 연구자들로 하여금 유망한 타겟으로 여겨질지라도 결국에 실패를 하지 않는데 결정적인 요소이다. 연구자들은 특정 타겟이 세포와 질병동물모델에서 다양한 실험을 통하여 연고 대상질환과 관련 있음을 증명해야 한다.
이러한 모든 과정이 타겟 검증이다. 검증된 타겟이란 약리학적으로 의미있는 효과를 나타내며 또한 장기간 임상적인 사용에서도 안전성이 입증된 것을 말하며 따라서 타겟검증은 이부분에 초점이 맞추어진다. 따라서 형질전환동물 (transgenic models)를 널리 사용하는데 타겟을 발현시키거나 (knock-in : 기능발현), 타겟을 제거한 (knock-out : 기능 상실) 동물을 사용하여 타겟검증을 수행한다.
V. Hit to Lead compound 도출
Target 이 검증되고 TPP 작성이 완료되면, 이 target 에 대한 hit 발굴을 위한 간단하면서도 선택성이 높은 "in vitro bioassay(생물학적 활성측정)"법을 확립하여야 한다. 이러한 과정을 in vitro POC (Proof of concept)라 한다. Hit 화합물을 선정하는 특별한 기준은 없으나 수십 uM 이하에서 10 uM 정도의 화합물을 선별한다. 또한 후속연구를 진행하기 위하여 화학구조가 정확한지를 확인해야 한다. 연구 초기에는 모두 확인하기 어려우나 PK data 를 in silico 에서 수행하여 개발 가능성이 있는지에 대한 검증도 수행되며, lead 화합물의 효과적인 발굴을 위하여 화학 구조적 다양성을 갖는 3~5 종 이상의 scaffold 를 확보함이 필요하다.
생물학적 타겟에 따라 기존에 확보하고 있는 화합물 library 수천 개를 대상으로 다양한 검색을 하여 보통 여러 개의 1 차 hits (primary hits)를 선별 해 낸다. 1 차 hits 는 활성과 관련, 제한된 data 만 확보한 상태로 생물학적인 활성을 검증하는 단계를 거친다. Hit 화합물이 발굴되면 combinatorial chemistry 등과 같은 고속합성기술을 이용하여 hit 의 다양한 유도체를 합성하여 더욱 효과가 좋은 lead 를 도출한다. 또한, 연구자의 경험을 이용한 SAR (Structure Activity Relationship) 연구를 수행하여 hit 화합물의 개량을 시도한다. 예를 들면 hit 화합물의 구조를 몇 개의 부분으로 나눈 후 각 부분에 다양한 치환기를 도입하는 가설을 세운 후 활성평가를 수행하고 가설의 검증을 수행하는 방식으로 진행한다.
Hit 에서부터 Lead 를 도출하는 단계에서 진행된 SAR 연구를 통하여 화학구조와 target 에 대한 상관관계를 규명함으로써 구조를 최적화해 나간다. 이 과정에서 hits 는 보다 강하고 (potent) 선택적 (selective)으로 작용하고 적합한 in vivo models 에서 약효 (efficacy)를 나타낼 수 있는 PK 특성을 보유하고 있는지 평가한다. 이때 각 핵심구조 부위에 대해 SAR 연구를 집중하고 각 compound 의 효능과 선택성을 확인한다. 따라서 lead 화합물은 정확한 정의는 없으나 다음 정도의 화합물을 말한다.
가. 수 백 nM 수준의 효과를 나타낸다
나. 타겟에 대한 유효성이 어느 정도 확인되었다
다. Mechanism of action (reversible/irreversible, kinetics) 이 확립되었다
라. 다른 분자타겟에 작용하는지 선택성을 확인하였다.
마. 경쟁력 또는 신규성을 포함한 특허성을 확인하였다.
바. Preliminary PK in vivo (rodent)
VI. Lead 최적화 / Candidates 도출
Lead 화합물 최적화를 통한 Candidates 선정은 hit-to-lead 과정과 유사하며, candidate 는 정해진 조건은 없으나 다음의 특징을 갖는다.
가. 100 nM 이하의 EC50 또는 IC50
나. 유사한 타겟과 1,000 배 정도의 선택성
다. HERG channel 을 포함한 안전성
라. 적절한 용해도
마. 적절한 in vivo PK parameter
바. 주요 CYP 에 대한 inhibiton 또는 induction 확인
마. 적합한 동물 모델에서의 약효
바. 단회투여 또는 2 주 정도의 독성시험에 대하여 안전성 확보
사. In vitro mutagenicity(Ames fluctuation test, in vitro Micronucleus test)
아. 특허 출원
Lead compound 가 선정되면 Lead compound 의 유도체 합성을 통하여 최적의 활성을 갖는 물질들을 확보하고 SAR(structure-activity-relationship) 을 확립한다. 이 단계에서 기본적인 약리 및 초기 스크리닝 독성시험과 ADME study 를 통하여 후보물질을 선정한다. Lead 최적화의 목적은 lead 화합물들의 우수한 특성은 유지시키면서 lead 구조에서 단점은 개선시키는 것이다. Lead 의 potency 및 efficacy 를 개선하고 타겟 외의 활성을 감소시키거나 배제시키며 아울러 선택성, 대사 안정성 (metabolic stability) 등을 최적화 시키는 것이다. 초기 lead 화합물들 보다는 hERG 에 대한 작용은 최소화시키고 흡수는 개선시키기 위하여 hERG affinity 와 Caco-2 투과도 시험을 하고 타겟에 대한 이들 물질들의 효력 (potency) 와 선택성은 유지하면서 hERG 친화도는 최대한 감소되고 투과도는 개선된 물질들을 찾아낸다. 이 과정에서 SAR (structure-activity-relationship) 연구를 통해 hits 의 구조를 화학적으로 수식 (modification)하거나 타겟의 구조에 대한 정보가 있을 경우에는 구조를 기반으로 디자인을 적용하여 진행하는 경우가 많다.
VII. 신약 후보물질의 발굴 방법론
1. HTS (High Throughput Screening)
HTS 란 많은 화합물 library 를 이용하여 새로운 타겟에 대한 hit 화합물을 빠른 시간 내에 발굴하는 방법을 말한다. 무작위적인 화합물 library 검색은 자체에 보관중인 화합물 library 를 이용하거나 구입 가능한 library 를 이용하기도 한다. 외국의 제약사는 구조가 결정되고 순도가 높은 자체 library 수 백만종을 보유하고 있으므로 새로운 타겟이 발굴되면 hit 화합물을 선별하는데 이용하고 있다.
그러나 자체 library 는 제한된 scaffold 로 인하여 구조적인 다양성이 제한되어 있는 단점도 있다. 화합물의 순도 또한 중요하게 평가되고 있다. 불순물이 많은 경우에는 false positive 결과가 많아 궁극적으로 비용과 시간의 낭비가 발생하는 문제점으로 지적되어 library 의 순도 확보에 노력을 기울이고 있다. HTS 를 위한 화합물의 library 종류는 화학적으로 합성된 화합물이 많으나, 천연물로부터 추출한 천연물 추출 분획 등 다양하게 이용할 수 있다. 아래의 표는 다국적 제약사 4 곳의 HTS 유래 프로젝트의 신약개발 단계별 비율을 나타낸 것이다. 이처럼 신약개발을 수행하는 많은 경우 HTS 기술이 폭 넓게 적용되고 있다.
분자타겟에 대해 각 물질의 활성검색은 HTS 로 실시한다. 또한 화합물들의 흡수, 분포, 대사 및 배설 (ADME, absorption, distribution, metabolism, excretion) 특성은 물론 물리화학적 성질 (physicochemical properties)이나 약물동태 (PK)에 대한 자료를 얻기 위해 디자인된 여러 가지 in vitro assays 를 실시한다. 원하는 타겟에 대한 선택성 파악도 중요하다. 예를 들면 원하는 kinase X 는 억제하고 원치 않는 in vivo side effects 는 줄이기 위해 kinase Y 에는 작용하지 않는 것을 입증한다. 어떠한 검색방법을 사용할지라도 hits 는 일반적으로 약물 타겟에 대해 100 nM ~ 5 uM 정도의 효능(potency)을 가지며 화학적인 방법을 동원하여 hits 의 효능을 개선하는 과정을 거친다(lead 도출). 또한 유도체 확장가능성과 특허가능성을 염두에 두고 화합물을 선택한다.
2. CADD (Computer Aided Drug Design)
최근에는 컴퓨터를 이용한 drug design 을 많이 수행한다. 컴퓨터를 이용한 방법은 크게 신약 타겟의 구조를 3 차원으로 구성한 후 화합물들의 일부분을 바꾸는 방식으로 가장 우수한 결합력을 예측하는 구조를 도출하여 합성을 수행하는 방식으로 진행한다. 이와 같이 타겟단백질의 3 차원 구조를 구성하여 약효가 있는 hit 를 발굴하는 방법을 structure based drug design 이라 한다.
다른 방법은 효과를 나타낸 hit 화합물들의 구조를 상호 비교하여 가장 효과가 우수하게 예측되는 화합물을 얻는 ligand based drug design 방법을 이용한다. 두번째는 기존에 알려진 구조와 활성의 상관관계에 의거하여 특정한 scaffold 를 분야별로 나누어 hit 화합물 발굴에 이용하기도 한다. 타겟에 대한 충분한 구조적인 정보와 컴퓨터를 이용한 ligand based drug design 을 통하여 효과가 예상되는 scaffold 를 선별하여 효과를 검색하고 hit 화합물을 발굴하는 방법이 있다.
마지막으로는 컴퓨터를 이용한 virtual screening 방법이 있다. 가상공간에서 3 차원 구조를 구성한 타겟을 구축하고 화합물의 3 차원 구조를 구성하여 결합을 예측하는 방식으로 최근에는 단백질의 구조와 기능에 대한 정보의 증가와 기기 및 software 의 발달로 각광을 받고 있다. 빠른 시간내에 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나 자체결과만으로는 의미가 없으며 반드시 in vitro 또는 in vivo screening 으로 효과를 입증해야 한다.
3. 전통적인 의약화학
의약화학(medicinal chemistry)은 후보물질 확인에 있어서 병렬합성, 약물대사 및 약동학 변수의 최적화, 물리화학적 변수들의 최적화, 연구 수단으로서의 화합물 생성 등에 중요한 역할을 해 왔다. 초기에 발굴된 hit 화합물을 분석하고 유도체를 합성하거나 다양한 치환기를 도입하여 약효를 증가시키는 방법인 전통적인 의약화학은 여전히 중요한 위치를 차지한다. 다만 다양한 유도체를 만드는 방법은 ligand based drug design 기술의 발달로 보다 폭넓게 발전하여 의약화학자의 경험에 의존하여 합성하는 전통적인 방법을 개선시키는 방향으로 진행되고 있다.
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