독성시험의 정의 및 종류
독성시험은 생체에 있어 바람직하지 않은 약물 작용을 평가하는 시험으로 의약품을 개발하기 위해 임상시험 이전 단계에서 실험동물을 이용하여 안전성을 평가하는 시험입니다. 독성시험에는 설치류 및 비설류를 이용한 단회투여 독성시험, 설치류 및 비설치류를 이용한 반복투여독성시험, 복귀돌연변이시험, 소핵시험, 염색체이상시험 등을 포함하는 유전독성시험, 수태능 및 초기배 발생시험, 배태자 발생시험, 출생전후 발생 및 모체기능시험 등을 포함하는 생식·발생독성시험, 랫드와 마우스를 이용하는 발암성시험 그리고 국소독성, 의존성, 항원성 및 면역독성, 작용기전독성, 대사물에 대한 독성시험, 불순물에 대한 독성시험 등을 포함하는 기타 독성시험으로 분류됩니다.
단회투여독성시험
단회투여독성시험은 시험물질을 시험동물에 단회투여 혹은 24시간이내 분할 투여 포함하였을 때 단기간 내에 나타나는 독성을 질적, 양적으로 검사하는 시험으로 1종이상의 설치류와 1종 이상의 토끼를 제외한 비설치류를 이용하여 시험합니다.
비설치류의 경우는 반복투여독성시험을 위한 용량설정시험인 DRF 시험으로 단회 투여독성시험을 대체할 수 있습니다. 단회투여독성시험시는 최소한 1종에 대해 암·수 모두 조사하고 결과 해석 가능한 충분한 동물수를 배정하여야 하는데, 일반적으로 설치류의 경우 군당 5마리 이상, 비설치류의 경우는 군당 2마리 이상으로 시험을 실시합니다. 시험물질의 투여경로는 임상적용경로와 정맥투여를 포함하는 적어도 최소 2개 이상의 투여경로로 시험하여야 하벼, 경구투여로 시험하는 경우 시험전 절식이 필요합니다. 용량단계는 설치류의 경우는 개략의 치사량을 구하기에 적절한 용량단계로 설정하여야 하며, 비설치류의 경우에는 독성증상을 명확히 관찰하기에 적절한 단계 설정를 설정하는 것이 바람직하며 2주간 관찰하게 됩니다.
시험결과에는 개략의 치사량 혹은 독성증상을 명확히 관찰할 수 있는 용량을 기술하여야 하며, 일반증상관찰기록, 체중측정기록, 육안적 해부소견 및 필요시 이상장기에 대한 병리조직학적 검사결과를 포함할 수 있습니다. ICH 가이드라인에서는 단회투여독성시험이 반복투여독성시험에 비해 추가적인 정보를 주지 못하므로 사람에서 약물을 과량으로 투여시 나타날 수 있는 증상을 예측하기 위한 목적으로 1종의 실험돔물에 임상적용경로로 투여하여 임상3상전 제출하도록 권고하고 있습니다.
반복투여독성시험
반복투여독성시험은 시험물질을 시험동물에 반복투여하여 중․장기간 내에 나타나는 독성을 질적, 양적으로 검사하는 시험으로 가장 기본적인 독성시험이면서 가장 중요한 시험입니다. 실험동물은 1종이상의 설치류와 1종이상의 비설치류를 사용하며 설치류의 경우 군당 암․수 각각 10마리 이상, 비설치류의 경우 군당 암․수 각각 3마리 이상을 사용합니다. 투여경로는 원칙적으로 임상적용경로로 투여하며 투여기간은 임상시험기간 및 임상사용 예상기간에 따라 설정하여야 합니다.
용량단계는 폐사되지 않고 충분한 독성을 관찰할 수 있는 용량을 고용량으로 설정하고 용량반응관계가 나타날 수 있는 중용량, 독성이 관찰되지 않을 겻으로 예상되는 용량을 저용량으로하여 최소 3개 이상의 시험물질 투여군을 두어야 하고 음성대조군 및 필요에 따라 비투여대조군이나 양성대조군을 둘 수 있으며 필요시 독성동태군 및 회복군 설정을 설정할 수 있습니다. 반복투여독성 시험의 측정항목은 일반증상, 사료섭취량, 물 섭취량, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 뇨검사, 안과학적 검사, 기타 기능검사, 장기중량, 병리조직학적 검사 등이 있습니다.
반복투여독성시험의 투여기간 설정 및 고용량 설정방법
반복투여독성시험의 투여기간은 임상시험 혹은 실제 임상에서 투여되는 기간에 따라 설정하여야 합니다. 예를 들어 임상1상시험의 투여기간이 2주이내라면 2주 이상의 설치류 및 비설치류 반복투여독성시험이 요구되며, 임상3상시험의 기간이 3개월이내라면 3개월이상의 설치류 및 비설치류 반복투여독성시험자료가 필요합니다. 만약 품목허가시 임상투여기간을 3개월이상으로 설정하려면 6개월이상의 설치류에 대한 반복투여독성시험자료와 9개월이상의 비설치류에 대한 반복투여 독성시험자료가 요구됩니다.
ICH가이드라인에 제시된 단회투여독성시험, 반복투여독성시험 및 In Vivo 유전독성시험의 고용량 설정방법에 대해 알아봅시다. 단기독성시험을 통해 폐사가 일어나지 않을 정도로 예측되는 최대내성용량, 투여용량을 높여도 약물의 노출이 더 이상 증가되지 않는 최저용량인 노출포화용량, 용해도 점도 등 다양한 원인에 의해 실질적으로 투여가능한 최대용량인 최대투여가능용량, 혹은 임상에서의 최대 노출의 50배 노출에 해당하는 용량, 한계용량인 1000mg/kg 중에서 가장 낮은 용량을 반복투여독성시험의 고용량으로 설정할 수 있습니다
유전독성시험
유전독성은 기존에는 세포 또는 개체 수준에서 돌연변이(mutation)를 유발하는 성질을 의미하였으나 현재는 유전물질(DNA)에 상해성을 나타내는 성질 (genotoxicity)을 포함하는 광범위한 의미로 사용되고 있습니다. 대표적인 유전독성시험으로는 첫째, 증식에서 histidine 혹은 tryptophan을 필요로 하는 살모넬라 혹은 대장균의 변이균주에 시험물질을 가하여 돌연변이가 복귀되어 histidine 혹은 tryptophan 이 없는 환경에서도 증식하는 균주로 복귀되는 균의 수를 측정하는 시험인 박테리아를 이용한 복귀돌연변이 시험, 둘째, 사람 또는 포유류의 배양세포를 이용하여 화학물질의 염색체이상 유발 유무와 유발 정도를 검색하는 포유류 배양세포를 이용한 체외 염색체이상 시험, 셋째, trifluorothymidine(TFT)의 세포독성효과에 내성을 갖는 thymidine kinase(TK) 결핍 돌연변이세포에 시험물질을 가하여 TFT에 감수성이 있는 정상세포로 변이되는 세포의 콜로니 크기로 유전독성 정도를 검색하는 체외 마우스림포마 tk 시험 마지막으로 설치류 골수 세포 중 다염성적혈구에 출현하는 소핵을 지표로 하여 시험물질의 염색체 이상 유발을 체내(in vivo)에서 평가하는 설치류 조혈세포를 이용한 체내 소핵시험 등이 있습니다.
유전독성시험법의 선택 (ICH S2R1)
ICH에서는 유전독성시험 중 체외염색체이상시험과 마우스림포마시험이 상대적으로 높은 의양성결과를 나타냄에 따라 시험방법을 일부 변화시키거나 시험항목을 변경할 수 있는 새로운 가이드라인을 2011년 11월에 발표하였습니다.
이 가이드 라인에 따르면 전통적인 표준시험법인 Ames test, CA test(혹은 MLA test) 및 MN test로 시험하였을 때 CA test(혹은 MLA test)에서 양성이 나오는 경우 반복투여 독성시험과 결합한 소핵시험과 LIver Comet 시험을 실시하여 음성이 나오면 유전 독성의 우려가 없는 물질로 판단할 수 있으며, 또 다른 표준시험법으로 Ames test와 반복투여독성시험과 결합한 소핵시험 및 LIver Comet 시험을 실시할 수 있 도록 하고 있습니다.
생식·발생독성시험
생식발생독성시험은 시험물질이 포유류의 생식･ 발생에 미치는 영향을 규명하는 시험으로 시험을 발생 단계에 따라 세가지로 분류됩니다. 수태능 및 초기배 발생시험은 암컷과 수컷 모두에 시험물질을 투여하여 독성을 평가하는 것으로 주로 랫드를 이용하며 투여기간은 수컷은 교배 4주전 암컷은 교배 2주전부터 투여를 개시하여 수정란이 자궁에 착상되는 시기인 교미 후 7일까지 약물을 투여하고 분만전 부검하여 교미율, 착상율, 생존율, 흡수율 등을 측정하는 시험입니다. 배태자 발생시험은 최기형성시험이라고도 하며 암컷에만 약물을 투여합니다. 실험동물로는 랫드와 토끼를 사용하며 투여기간은 교미 7일째인 착상시부터 경구개가 폐쇄되는 시기인 교미 18일째까지 투여하고 분만전 제왕절개하여 태자의 외표, 장기 및 골격의 이상유무를 검사하는 시험입니다.
출생전후 발생 및 모체기능시험은 암컷에만 약물을 투여하는 시험으로 주로 랫드를 이용하여 시험을 실시하며 시험물질투여기간은 교미 7일째인 착상시부터 분만 후 이유기까지 모체에 약물을 투여하여 태반이나 유즙을 통해 전달된 약물이 차산자에게 미치는 영향을 평가하는 시험입니다. 생식발생독성시험의 수행시기는 식약처 고시인 의약품등의 독성시험기준에 따라, 반복투여독성시험에서 생식기관의 이상이 관찰되지 않았을 경우, 남성을 대상으로 임상시험을 수행하려면 수컷 생식발생독성시험자료를 임상 3상전에 제출하여야 하며, 임신가능성이 없는 여성을 대상으로 임상시험시험을 실시하는 경우는 암컷 자료를 임상 3상전에 제출하고 임신가능성이 있는 여성을 대상으로 임상시험을 실시하는 경우는 암컷의 생식발생독성시험자료를 임상시험 개시전에 제출하여야 합니다.
생식발생독성시험의 수행시기 (ICH M3R2)
ICH가이드라인에서는 생식발생독성시험의 제출시기를 좀 더 세분화하여 제시하고 있는데, 그 내용을 살펴보면, 남성을 대상으로 임상시험을 수행할 경우는 식약처의 가이드라인과 동일하게 임상 3상전 수컷에 대한 생식발생독성시험자료를
제출하여야 하지만, 비가임여성의 경우 반복투여독성시험에서 생식장기에 이상이 없는 경우는 생식발생독성시험을 제출하지 않아도 됩니다.
가임여성이 임상시험기간동안 피임을 하는 경우는 수태능 및 초기배 발생시험자료는 임상3상전에 제출하여야 하며, 배태자발생독성시험자료에 대해서는 2주 이내의 임상시험은 자료의 제출없이 임상1상 및 2상시험을 실시할 수 있으며, 3개월이내 150명 이내의 임상시험의 경우는 랫드 및 토끼에 대한 배태자발생독성 예비시험자료를 제출하면 임상시험을 실시할 수 있고, 출생전후 발생 및 모체기능시험은 품목허가신청 전에 제출토록 하고 있습니다. 피임을 하지 않는 가임여성이 임상시험에 참여하는 경우는 모든 생식 및 유전독성시험자료를 임상시험전에 제출하여야 하며, 임신여성이 임상시험에 참여하는 경우는 모든 생식 및 유전독성시험자료 뿐 아니라 추가 임상시험자료도 제출하여야 합니다.
발암성시험
발암성시험은 동물에서의 종양 유발을 검색함으로써 사람에서의 발암성 위험을 예측하기 위한 시험으로 발암성이 예측되는 의약품과 임상적으로 장기간 사용되는 의약품의 경우에 발암성시험이 필요합니다. 발암성이 예측되는 의약품이라 함은 당해 의약품 또는 그 대사산물의 화학구조 또는 생물학적 활성이 이미 알려진 발암물질과 유사하거나 반복투여독성시험 또는 유전독성시험결과 발암성이 의심되는 것을 말하며 임상적으로 장기간 사용되는 의약품이란 류마티스성 만성관절염에 사용하는 소염진통제나 본태성 고혈압에 사용하는 혈압강하제와 같이 임상적으로 대다수 사용례가 6개월을 초과하는 의약품을 말합니다.
발암성시험에는 랫드와 마우스가 가장 많이 사용되며 시험군당 암수 각 50 마리 이상을 사용하여야 하고, 대조군을 포함하여 4개 이상의 용량군으로 구성합니다. 투여기간은 24개월로 하되 대조군이 25%이하로 생존하는 경우 투여를 종료할 수 있습니다. 독성동태를 위한 시험은 최소 6개월이상 투여하여야 하며, 측정항목은 조직병리학적 검사를 통해 발암성을 평가하고 혈액암이 의심될 경우에는 혈액도 말표본을 이용하여 세포 개수를 실시합니다.
미국 FDA의 Carcinogenicity Assessment Committee에서는 발암성시험 계획서를 검토해 주는 Special Protocol Assessment제도가 있어서 이를 이용할 경우 투여용 량의 설정이나 시험계획의 조언을 받을 수 있습니다. SPA에 필요한 자료로는 약효, 임상1상, 단백결합, 대사, 배설, CYP effect, 유전독성, 13주 용량설정시험의 결과 등이며 검토결과는 60일 이내에 받을 수 있습니다
기타독성시험
기타독성시험으로는 국소독성시험, 의존성시험, 항원성 및 면역독성시험, 작용기 전 독성시험, 대사물에 대한 독성시험, 불순물에 대한 독성시험 등이 있습니다. 국소독성시험은 피부 또는 점막에 직접 적용되는 의약품에 대해 실시하는 시험이며 정맥투여제제인 경우에는 국소내성시험을 실시하여야 합니다. 의존성시험은 중추신경계에 작용하는 약물에 대해 실시하는 시험으로 ICH에서는 안전성약리시험으로 분류하고 있습니다. 항원성시험은 고분자 물질, 단백성의약품, 합텐으로 작용할 수 있는 저분자물질에 대해 실시하는 시험이며, 면역독성시험은 반복투여 독성시험결과 면역계에 이상이 있는 경우에 실시하며, 반복투여 독성시험과 병행하여 실시할 수 있습니다.
작용기전독성시험은 작용기전에 따라 나타날 수 있는 독성을 평가하는 시험을 말하고, 대사물에 대한 독성시험은 Human과 동물에서의 대사가 다를 경우에 사람에서의 주 대사체에 대해 동물에서 충분한 독성평가가 이루어지지 않았을 때 실시하는 시험입니다. 여기서 주 대사체의 기준이 미국 FDA와 유럽의 EMEA에서 다르게 정의하고 있는데, 미국 FDA에서는 원체의 혈중 AUC대비 10% 이상의 혈중 AUC를 가지는 대사체를 의미하지만 유럽의 EMEA에서는 원체와 그 대사물을 모두 포함하는 관련 화합물의 혈중 AUC대비 10% 이상의 혈중 AUC를 가지는 대사체를 의미합니다. 불순물에 대한 독성시험은 사람에서 하루 2g이하 투여되는 약물의 경우 단일불순물이 0.15%이상 혼입되어 있거나 하루에 1.0 mg이상 투여될 수 있는 불순물에 대해 실시하며 사람에서 하루 2g이상 투여되는 약물의 경우는 단일불순물이 0.05%이상 혼입되어 있으면 실시하여야 합니다.
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