반응형 세포생물학실험 | SDS-Page TIP SDS-PAGE는 DNA를 전기영동으로 분리하여 크기를 알아보듯이 단백질도 SDS를 이용하여 전하는 모두 잃게 하고 크기에 의해 분리되게 만들어 전기영동을 통해 단백질의 크기를 알아본다. Sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)는 단백질을 정제하는 동안 이를 monitor하고, 정제된 단백질의 동질성(homogeneity)을 알기 위한 가장 좋은 방법이다. SDS-PAGE는 일반적으로 단위체의 분자량을 결정하고, 정제된 단백질의 단위체 구성을 알기 위해 사용된다. SDS-PAGE는 더 깊은 연구를 위한 충분한 단백질을 얻기 위해 scale up될 수 있다. 실험 방법1. 실험 과정1) 각 lane 별로 30㎕.. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 4. 30. 생명과학실험 | 단백질 발현과 정제 TIP 1. 단백질 발현의 목적 : 특정 유전자를 통해 얻고자 하는 단백질을 대량 생산할 수 있다. 2. 단백질 정제의 목적 : 단백질을 순도 높게 분리 및 정제함으로써 수많은 단백질 중 원하는 단백질만을 얻기 위함이다. 단백질 발현 재조합 단백질 기법은 외부 유전자를 플라스미드 벡터에 삽입하여 숙주 세포에 도 입하면 마치 숙주 세포의 유전자처럼 발현되는 기법이다. 알로락토오스와 유사한 IPTG를 이용해 Lac repressor와 결합하게 함으로써 lac operator와의 결합을 방해하 여 전사가 일어나도록 한다. 유전자 과발현 시 단백질의 정제가 쉬워지고 정제의 수율이 올라간다. 실험 방법 1. 단백질 발현 1) 알코올램프를 켜고 피펫을 사용해 kanamycin(항생제)을 일부 덜어 SB배양액에 넣고.. Biology/생명 과학 | 공학 2021. 8. 18. 분자생물학실험 | 재조합 단백질 Taq DNA polymerase 발현, 정제 및 확인 실험 방법 1. 재조합 단백질 Taq DNA polymerase 발현 Ampicillin 배지 뒷면에 cell 이름, streaking한 날짜, 본인 이름 등을 써주고 여기에 streaking을 할 Cell stock을 얼음에 가져온다. 팁 끝을 살짝 알코올램프에 대어 주고 식힌 뒤 cell stock을 조금 묻혀 배지에 streaking 한다. 37℃ incubator에 streaking한 LB plate를 뒤집어 넣어 하루간 키운다. 그 다음날 plate를 꺼내 inoc㎕ation과정을 거쳐준다. 먼저 Conical tube에 라벨링을 해주고 (LB AMP 50㎖) LB 50㎖에 맞춰 항생제를 50㎍/㎖가 되게 넣고 위 아래로 흔든다. 그리고 유리실험관에 LB를 6㎖씩 분주해 줍니다. (총 4개) 하.. Biology/분자생물학 2021. 3. 8. 일반생물학실험 | PCR & Molecular Cloning PCR 1. Primer design 원리 목표로 하는 DNA 시퀀스의 시작과 끝부분에 상보적으로 결합해서 DNA 중합효소가 DNA 중합을 시작할 수 있도록 '시발체' 역할을 해주는 짧은 다염기체이다. DNA 복제에 primer가 필요한 이유는 과정을 촉매하는 효소인 DNA중합효소가 이미 존재하는 유전자 가닥에 새로운 nucleotide를 붙이는 역할만 할 수 있기 때문이다. DNA중합효소는 primer의 3'end에서 시작하여 반대편 가락을 복제한다. 목표 시퀀스에 상보적인 아무 염기서열이나 마구잡이로 정해서 primer를 만드는 게 아니라 이 primer의 염기 구성이 어떠냐에 따라서 PCR의 효율이 큰 영향을 받기 때문에 최적의 primer를 만들기 위해서는 갖춰야 할 조건들이 있다. 먼저 길이는 .. Biology/일반 | 세포 생물학 2021. 1. 26. 생명과학실험 | Protein Purification과 Electrophoresis(SDS-PAGE) TIP 추출해낸 Protein을 Purification하여 원하는 단백질만을 얻어내는 방법을 알아보고, SDS-PAGE Gel을 이용해 Electrophoresis하여 직접 눈으로 확인한다. 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography) 1) 친화성 크로마토그래피는 단백질과 지지체 위에 결합되어 있는 ligand 사이의 특이한 화학적 상호작용에 기초로 하는 분리 방법 예) 효소-억제제, 항원-항체 반응 2) Ligand 와 단백질 사이의 친화성 결합은 분자의 크기와 모양에 특이적인 결합 (Specific binding) 3) Column 내 정지상에 단백질과 상호작용하는 ligand 를 결합시킨 지지체 사용 4) 친화성 크로마토그래피에서 ligand 를 붙일 때 고체 matrix 에.. Biology/생명 과학 | 공학 2020. 9. 14. 생명과학실험 | Protein purification TIP 가. 미생물을 이용하여 대량 생산하였던 원하는 단백질만을 특이적으로 정제하려고 한다. 나. soluble 상태의 sample protein을 affinity chromatography 방법을 이용해 target protein만 추출한다. Affinity chromatography 효소의 기질 특이성과 같이 선택적으로 분리를 원하는 물질과 반응하는 특성을 가진 물질을 고정상으로 삼아 분리시키는 크로마토그래피이다. 예를 들어 효소와 기질, 항원과 항체, 호르몬과 수용체, 렉틴과 다당류, 핵산의 염기쌍 등의 사이에 작용하는 특이적 상호작용을 이용하여 상호작용물질의 한쪽을 불용성 담체에 공유 결합시킨 것을 크로마토그래피용 고정상으로 하고 다른 쪽을 복잡한 혼합계 중에서 선택적, 그리고 가역적으로 포착하여.. Biology/생명 과학 | 공학 2020. 9. 7. 생화학실험 | His–Tag 단백질의 정제 - Purification of His-tagged proteins TIP 1. 단백질을 정제하는 목적 1) 가능한 최고의 회수율 2) 최고의 생물학적 활성 유지 3) 최고의 순도 His-tag 단백질 / Ni-NTA 현재 재조합 단백질을 정제하는데 가장 많이 사용되는 방법이다. 다시말하면, 단백질을 구성하는 아미노산 중 히스티딘이 금속 이온과의 배위 결합에 강하게 관여한다는 연구 결과가 있다. 6개(혹은8개)의 His을 연속으로 달아놓으면 Ni등의 금속이온과 배위결합을 생성한다. Ni이 레진에 결합되어 있으면 His을 달아 Ni결합 레진에 단백질이 달라붙는데(Ni고정-NTA사용)이런 성질을 이용해 단백질을 정제한다. 따라서 유전자 공학적으로 단백질의 말단에 다수의 히스티딘을 첨가하면 단백질의 금속 이온 친 화성이 현저히 증가하여 쉽게 정제가 가능하다. 히스태그를 갖는 .. Biology/생화학 2020. 7. 5. 생화학실험 | Purification of Plasmid DNA TIP Bacteria의 plasmid에 대해 알아보고 DNA의 구조에 의한 추출 원리를 이해한다. Plasmid 세균세포내에서 염색체와 독립적으로 존재하며 증식할 수 있는 환형DNA. 모든 플라스미드는 복제 개시점이 될수 있는 적어도 한 개의 DNA염기서열을 가지며 큰 플라스미드는 자체에 복제 효소를 가지기도 한다. 세균의 생존에 필수적인 유전정보를 가지고 있는 것은 아니지만 플라스미드에서 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자,세균의 자웅을 결정하는 성결정인자등이 발견되고 있다. 제한효소로 고리를 끊은 뒤, 진핵생물의 DNA를 삽입하여 잡종 플라스미드를 만들어도 세균안에서 정상적으로 작동하고 증식하며, 이를 이용한 유전자 재조합을 통해 유용한 단백질을 얻을 수 있다. Vector 필요한 유전자를 잘라내어.. Biology/생화학 2020. 5. 19. 분자생물학실험 | Western blotting TIP 1. PTM(post-translational modifications)의 의미와 N-linked 와 O-linked glycosylation의 차이를 알 수 있다. 2. 균주 Hansenula polymorpha를 YPM배지에서 배양한 후, TCA down을 통해 세포외 단백질을 농축하여 얻고 cell lysis를 통해 세포내 GOD 단백질을 얻고 OD값 측정으로 단백질 정량을 할 수 있다. 3. SDS-PAGE의 방법과 원리를 이해하고 만들어 Western blotting을 통해 GOD 단백질의 발현 여부와 그 크기를 알 수 있다. SDS-Page Acrylamide를 가교제 (cross-linker)로 중합한 polyacrylamide gel은 acrylamide와 가교제의 농도 및 비율에 .. Biology/분자생물학 2020. 1. 31. 생화학개론 | 단백질 정제 TIP 1. 서 론 2. 단백질 정제의 목적 3. 단백질 용해 과정 4. 단백질의 안정화 5. 단백질의 분리 정제 및 농축 6. 정제된 단백질의 순도 검정 7. 정제된 단백질의 변형 및 오염물질에 대한 처리 단백질은 특이성 있는 효소의 촉매작용과 산소나 금속이온 등의 운반 그리고 세포 대사의 조절, 병인체로 부터의 방어, 구조단백질로 생체의 특정 형태 유지 등 다양한 생물학적 기능을 한다. 단백질들은 20여종의 아미노산으로 구성되어있지만 다양한 기능만큼 다양한 구조를 가지고 있다. 단백질은 구조와 기능이 다양함으로 몇 개의 부류로 분류하기는 어렵지만, 단백질의 3차구조에 따라 구형을 이루는 구상단백질과 섬유형을 하고 있는 섬유상 단백질로 나뉠 수 있다. 구상 단백질들은 헤모글로빈이나 사이토크롬 c와 같이.. Biology/생화학 2019. 11. 29. 생화학실험 | Protein Purification & SDS-PAGE TIP Protein Purification을 이해하고 SDS-PAGE 를 이용하여 Protein 을 정제해본다 전기영동 전기영동(electrophoresis)은 이온교환크로마토그래피와 마찬가지로 단백질분자의 전하를 이용한 분리, 분석법이다. 단백질 분자는 보통 등전점 이외의 pH에서는 양 또는 음의 전하를 가지고 있어서 일정한 pH의 완충액 중에서 직류전류를 가하면 양극 또는 음극방향으로 이동한다. 즉 단백질 분자의 전하량, 분자의 크기에 따라 전장 중에서 이동하는 속도가 다른 점을 이용하여 분리, 분석하는 것이다. 단백질을 여과지, 전분이나 agarose와 같은 다당류 gel, polyacrylamide gel 등과 같은 것을 담체로 하여 전기영동하면 단백질은 band를 형성하여 분리되므로 분리, 분.. Biology/생화학 2019. 11. 6. 생명과학실험 | Alkaline phosphatase의 정제 TIP Ion-exchange chromatography에 의한 단백질 정제 원리를 이해하고, DEAE anion exchange column을 이용한 AP 단백질의 정제기법을 습득하게 된다. Alkaline Phosphatase(AP) Phosphatase는 인산화 되어 있는 분자에서 인산기를 제거하는 효소이다. 대개 생체내의 효소는 특정한 기질과만 반응하는 기질 특이성을 지니는데, AP같은 경우에는 특정한 기질과만 반응하지 않는 nonspecific phosphatase에 해당한다. 이름에 alkaline이 붙는 이유는 이 효소가 작용할 수 있는 최적의 환경이 염기성이기 때문이다. AP는 보통 homo-dimer로 작용하며 크기는 140-160 kDa정도이다. (-)charge를 띠며, 75～85℃의.. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 10. 9. 분자생물학개론 | Protein Purifying TIP 1. The Preparative Ultracentrifuge 2. Organelles and Macromolecules Can Be Separated Separated by Ultracentrifugation 3. Cell fractionation by centrifugation 4. Velocity Sedimentation 5. Equilibrium Sedimentation 6. The Separation of molecules by Column Chromatography 7. Ion-Exchange Chromatography 8. Ion-Exchange Matrix 9. Protein purification by Ion-Exchange Chromatography 10. Gel-filtrati.. Biology/분자생물학 2019. 10. 4. 이전 1 다음 반응형
