반응형 일반생물학실험 | Plasmid DNA - 전기영동 TIP 1. 제한효소를 통해 절단된 plasmid DNA를 전기영동을 통해 확인한다. 2. 전기영동을 함으로써 그 원리와 방법을 익히도록 한다. DNA 전기영동 DNA를 크기에 따라 분리하기 위해 DNA 전기영동을 하는 것이다. DNA는 기본골격에 있는 인산기 때문에 전기영동에 사용되는 완충용액 속에서 (-)전하를 띠고 있어서 두 전극 사이에 위치해 있을 때 50V～100V 정도의 전류를 흘려주게 되면 (+)극 쪽으로 움직이게 된다. 이 때 gel은 그물모양으로 엮여있기 때문에 DNA 분자가 gel을 통과하는 속도는 분자량이 커질수록 늦어지며 젤의 밀도가 클수록 늦어진다. 또한 DNA의 분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다르다. 예를 들면 supercoil된 DNA는 선형 DNA 보다 빠르.. Biology/일반 | 세포 생물학 2024. 2. 6. 유전학실험 | Restriction enzyme digestion Treatment of Restriction Enzymes 제한효소를 이용한 절단은 적절한 반응조건하에서 DNA와 효소를 incubation시킴으로써 간단히 수행할 수 있다. 염 농도, pH, 반응온도, DNA 및 효소의 양 등이 효소반응의 변수로 작용한다. 제한효소의 1 Unit는 지정된 buffer와 지정한 온도에서 1시간 동안 λ DNA 1㎍을 완전히 분해하는데 필요한 양을 나타낸다. 1) 멸균한 200㎕ microtube에 다음과 같은 비율로 잘 혼합한다. 2) 37℃ incubator에서 약 2시간 정도 반응시킨다. 3) 전기영동하여 확인한다. 실험 방법 1. Protocol 1) 37℃ incubator에서 약 2시간 반응시킨 후 전기영동하여 확인한다. Plasmid DNA 16㎕ 10X R .. Biology/유전학 2024. 1. 9. 분자생물학실험 | Restriction digestion TIP 1. Plasmid DNA를 restriction enzyme(제한효소)로 처리하여 restriction enzyme의 특성과 plasmid의 특성을 이해한다. 2. Agarose gel 전기영동의 원리를 이해하고, 크기와 모양에 따른 DNA의 위치를 통하여 제한효소 지도를 작성한다. 실험 배경 restriction enzyme은 특이성에 따라 DNA의 특정한 site를 찾아서 잘라준 다. 이 실험에서 쓰이는 enzyme은 DNA상에서 특정한 site를 인식하여 T 와 C사이의 phosphodiester bond를 끊어준다. 그렇게 끊어주면 circular한 plasmid DNA는 잘려서 linear한 형태로 나타난다. agarose gel electrophoresis은 DNA 조각을 분리하고 인.. Biology/분자생물학 2023. 5. 17. 일반생물학실험 | 원형 DNA인 plasmid DNA Plasmid 세포 내에서 핵이나 염색체와 독립적으로 존재하면서 자율적으로 자가증식해 자손에 전해지는 유전요인이다. 1952년에 미국의 유전학자 J.레더버그가 세균류의 염색체 이외의 유전요인을 플라스미드라고 명명했는데, 최근에는 진핵생물도 포함해 세포질 인자와 같은 뜻으로 흔히 쓰인다. plasmid의 특징은 다음과 같다. 1) 원형의 이중가닥 DNA(circular double-standed DNA)이다 2) 세포내에서 염색체 DNA와는 별개로 존재 3) 자기 스스로 복제가 가능 4) 대부분 세균에 존재하나, 일부 진핵세포에도 존재 5) 복제기점(DNA 복제의 시작점으로 숙주 범위 및 plasmid DNA의 copy를 결정)이 존재한다 6) 항생제 저항성 유전자(R인자)를 가진다. 7) 다중 제한효소 .. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 9. 30. 일반생물학실험 | DNA 추출과 전기영동 TIP DNA 추출법을 알고, 전기영동의 원리를 이해한다. DNA 추출 1. Plasmid 세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA로, 고리 모양을 띠고 있으며 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니다. 유전공학에서는 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소로 끊은 뒤, 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자재조합 기술을 사용한다. 2. Plasmisd의 특징 ① 복제기점(original of replication)을 갖기 때문에 증식할 수 있다. ② 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene)을 가져 selection marker로 사용될 수 있다. ③ Multi cloning site(MCS)가 존재.. Biology/일반 | 세포 생물학 2021. 5. 1. 일반생물학실험 | 제한효소를 통한 DNA 분해와 전기 영동 TIP 추출해낸 DNA를 제한 효소를 사용하여 여러 개의 DNA 조각으로 분리한 후, 전기영동을 통하여 원하는 DNA 분자가 유입되었는지를 확인한다. 본 실험에는 DNA를 제한 효소로 절단하는 과정이 포함되어 있다. 제한 효소는 원래 세균이 침투한 외래 DNA를 변형 및 파괴시키기 위하여 존재하는 효소이다. 그러나 이 제한 효소는 그 세균의 DNA도 절단할 수도 있기 때문에 그것을 방지하기 위해 세균은 자신의 DNA에 메틸화(methylation)을 하는 등의 방법을 통해 자신의 DNA를 보호한다. 제한 효소는 이중 나선 구조로 된 DNA의 회문식 염기서열, 즉 앞으로 읽으나 뒤로 읽으나 염기서열이 같은 모양을 하고 있는 특징적인 염기서열을 인식하여 절단한다. 잘린 후의 DNA 말단의 모양은 두 종류가 .. Biology/일반 | 세포 생물학 2021. 2. 1. 일반생물학실험 | PCR & Molecular Cloning PCR 1. Primer design 원리 목표로 하는 DNA 시퀀스의 시작과 끝부분에 상보적으로 결합해서 DNA 중합효소가 DNA 중합을 시작할 수 있도록 '시발체' 역할을 해주는 짧은 다염기체이다. DNA 복제에 primer가 필요한 이유는 과정을 촉매하는 효소인 DNA중합효소가 이미 존재하는 유전자 가닥에 새로운 nucleotide를 붙이는 역할만 할 수 있기 때문이다. DNA중합효소는 primer의 3'end에서 시작하여 반대편 가락을 복제한다. 목표 시퀀스에 상보적인 아무 염기서열이나 마구잡이로 정해서 primer를 만드는 게 아니라 이 primer의 염기 구성이 어떠냐에 따라서 PCR의 효율이 큰 영향을 받기 때문에 최적의 primer를 만들기 위해서는 갖춰야 할 조건들이 있다. 먼저 길이는 .. Biology/일반 | 세포 생물학 2021. 1. 26. 일반생물학실험 | 제한효소에 의한 plasmid DNA 절단 - 전기영동 TIP 전기영동의 원리를 이해하고, 직접 시험관 내 plasmid DNA를 전기영동하여 본다. 제한효소를 이용한 DNA의 절단 및 붙이기 제한효소 1 unit는 1 ㎍의 DNA를 최적 온도에서 한 시간에 절단할 수 있는 양이다. 상품화된 효 소는 효소마다 다르지만 대개 10 units/㎕ 내외의 농도로 공급된다. 제한효소 처리 반응은 절단하 려고 하는 DNA, 반응완충용액, 제한효소로 구성된다. 각각의 성분에 대하여 다음과 같은 점들을 고 려해야한다. ① 자를 DNA 내에 제한효소로 잘리는 부위가 몇 개가 되는지 파악한다. 같은 양의 DNA에 제한효소 절단부위가 무수히 많을 수도 있고 없을 수도 있으며, 이들 경우에 같은 양의 효소작용을 기대할 수 없을 것이다. 그러나 보통 실험에서는 계산된 양보다 더 .. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 8. 26. 일반생물학실험 | 제한효소에 의한 DNA의 절단 TIP 1. 시험관 내에서 유전자를 조작할 때 쓰이는 도구인 제한효소로 Plasmid DNA를 잘라보고 분석한다. 또한 절단한 Vector DNA와 insert DNA를 ligase로 ligation해보고 대장균에서 그 형질을 발현 시켜 본다. 2. 생명공학의 기초가 되는 분자생물학의 기본실험인 미생물에서의 plasmid DNA를 절단하는 실험이다. 본 실험은 가장 기초가 되는 실험으로서 이 후에 하게될 전기영동 실험에서 응용하게 된다. 전기영동 실험에서는 거대분자들을 연구하기 위하여 사용하는 방법으로 PCR도 사용하게 된다. 이 실험을 통하여 DNA의 분리 및 확인을 알아보려고 한다 제한효소 (restriction enzyme) 제한효소 (restriction enzyme) 혹은 제한 내부핵산 가수분해.. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 8. 21. 전기화학실험 | Faraday' Law를 이용한 도금 공정 TIP 1. 제한요소(환경) 반영 전처리 공정 설계 능력을 배양한다 2. Faraday 법칙을 활용하여 도금 조건(시간 및 전류밀도)설계 능력을 배양한다. Faraday' law M.패러데이가 발견한 법칙으로 1833년 발견한 전기분해 법칙과 1831년에 발견한 전자기유도 법칙이 이에 해당한다. 1833년 발견한 전기분해 법칙과 이보다 2년 전에 발견한 전자기유도법칙이 있다. 전기분해 법칙에 의해 물질의 원자구조와 관련해서 전기량에도 최소 단위(기본 전하량)가 존재한다는 것이 처음으로 예측되었고, 전자기유도법칙은 전자기유도가 일어나는 방식을 밝혀냈다. 제 1 법칙에 의해 석출되는 물질의 양은 전류와 시간의 곱에 비례한다. 그리고 공급되는 전자가 전해질 속의 이온을 원자가 되게 하여 석출되므로, 석출되는 .. Engineering/그외 공학 2020. 7. 2. 생화학실험 | 대표적인 생화학 실험 TIP 1. 플라스미드 DNA를 통한 박테리아의 형질전환을 관찰한다. 2. selection marker의 원리를 이해하고, 박테리아를 selection한다. 3. PCR에 필요한 재료와 PCR의 원리를 이해하고, 플라스미드의 일부분을 증폭한다. 4. selection한 박테리아로부터 플라스미드를 추출하여 제한효소와 반응시킨다. 5. 제한효소와 반응시킨 플라스미드와 PCR로 증폭한 DNA를 λ/HindⅢ 마커와 같이 아가로오즈 겔로 전기영동을 하여 나오는 결과를 분석하고 이해한다. pBluescript SK & GDA의 구성 및 특징 Plasmid DNA의 일종인 pBluescript Ⅱ SK(+)는 [그림 1]과 같이 구성이 되어있으며 형질 전환시 암피실린의 내성이 생기는 DNA가 selection m.. Biology/생화학 2020. 2. 17. 미생물실험 | Recovery and digestion of the amplified DNA TIP PCR로 증폭된 DNA를 회수하여 절단한다. 그로 인해 형질전환 때, vector을 넣을 DNA를 얻고, 절단하여 vector를 넣고자 함이다. 이 때, vector DNA와 insert DNA 모두 같은 효소로 같은 위치를 절단하고자 한다. Restriction enzyme(제한효소) DNA 특정부위를 자르고 붙일 수 있다. DNA를 자른다는 것은 nucleotide들이 연결되어 있는 인산디에스테르결합(phosphodiester bond)을 끊어내는 것을 의미하는데, 이런 역할을 하는 효소를 nuclease라고 하며 바깥쪽을 자르면 exonuclease, 안쪽을 자르면 endonuclease라고 부른다. endonuclease의 대표적인 것이 바로 제한효소(restriction enzyme / .. Biology/미생물학 2020. 1. 27. 분자생물학개론 | Cloning vector for E. coli TIP 1. Cloning vectors based on E. coli plasmids 2. Cloning Vectors Based on M13 Bacteriophage 3. Cloning Vectors Based on λ Bacteriophage 4. λ and other high capacity vectors enable genomic libraries to be constructed 5. Vectors for other bacteria 1. Cloning vectors based on E. coli plasmids Gene cloning에서 가장 널리 사용되는 가장 단순한 cloning vector들은 작은 bacterial plasmid에 기초하고 있다. 매우 많은 plasmid vector들이 .. Biology/분자생물학 2019. 11. 4. 생화학실험 | Digestion, Extraction and Ligation of DNA TIP 제한효소와 플라스미드에 대해 알아보고 DNA 재조합 과정을 이해한다. 유전정보를 가지는 거대분자인 DNA 분자, 즉 유전자를 인간의 손으로 시험관내에서 자유로이 절단하거나 붙여 어떤 생물의 염색체 중에 삽입하여 목적으로 하는 특정의 유전자를 증식시키고 발현시키는 것이 가능해 졌다. 이와 같이 유전자를 인위적으로 조작하여 어떤 생물의 유전자에 다른 생물의 유전자를 삽입하고 그 유전자를 단일 clone으로 증식시키거나 발현시키는 것을 DNA 재조합 또는 유전자 조작이라고 한다. 유전자 재조합 기술은 생물학의 연구에 있어 가장 기본이 되는 것으로, 원하는 유전자 만을 증폭하거나, 특정 유전자를 다른 유전자와 재조합 시킬 수 있으므로 그 유전자의 역할 구명에 큰 이바지를 하고 있다. 그런 유전자의 역할은.. Biology/생화학 2019. 10. 28. 유전학실험 | subcloning I(digestion) TIP 우리가 확인하고자 하는 promoter의 활성을 측정하기 위한 실험과정중 하나로써, 이미 vector에 붙어있는 promoter에서 일부분을 자르기 위해 vector를 restriction enzyme(restriction endonuclease)을 이용하여 잘라낸 후 그 크기들을 확인한다. 1. genomic DNA와 plasmid DNA의 차이 2. subcloning 3. electrophoresis 4. restriction enzyme 5. promoter gene & reporter gene 실험 방법 1. 실험 과정 1) plasmid DNA인 pMB01을 준비한다. 2) Microfuge tube에 DDW 12.5㎕, DNA(pMB01) 5㎕, enzyme(BamHI)을 일정량 넣고.. Biology/유전학 2019. 10. 24. 분자생물학개론 | Manipulation of Purified DNA - 정제된 DNA의 조작 TIP 1. DNA를 조작하기 위해 사용되는 효소들의 종류 2. DNA 절단용 효소 : 제한 효소(Restriction endonucleases) 3. Ligation - DNA 분자들을 서로 연결시키기 1. DNA를 조작하기 위해 사용되는 효소들의 종류 이들 효소는 이들이 촉매하는 반응의 유형에 따라 5가지로 나눌 수 있다. (1) 핵산 분해 효소(Nucleases) : 포스포디에스테르 결합을 끊음으로써 DNA 분자들을 분해시킴 1) Exonuclease(엑소뉴클레아제 또는 외부 핵산 분해 효소) : DNA 말단부터 한번에 하나씩의 뉴클레오티드를 제거시키는 효소로서, 이중가닥을 공격할 때 분해시키는 가닥의 수로 세분한다. ① BAL31(from the bacterium Alteromonas espeji.. Biology/분자생물학 2019. 10. 21. 이전 1 다음 반응형
