반응형 일반생물학실험 | Plasmid DNA - 전기영동 TIP 1. 제한효소를 통해 절단된 plasmid DNA를 전기영동을 통해 확인한다. 2. 전기영동을 함으로써 그 원리와 방법을 익히도록 한다. DNA 전기영동 DNA를 크기에 따라 분리하기 위해 DNA 전기영동을 하는 것이다. DNA는 기본골격에 있는 인산기 때문에 전기영동에 사용되는 완충용액 속에서 (-)전하를 띠고 있어서 두 전극 사이에 위치해 있을 때 50V～100V 정도의 전류를 흘려주게 되면 (+)극 쪽으로 움직이게 된다. 이 때 gel은 그물모양으로 엮여있기 때문에 DNA 분자가 gel을 통과하는 속도는 분자량이 커질수록 늦어지며 젤의 밀도가 클수록 늦어진다. 또한 DNA의 분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다르다. 예를 들면 supercoil된 DNA는 선형 DNA 보다 빠르.. Biology/일반 | 세포 생물학 2024. 2. 6. 화학생물공학실험 | 플라스미드 추출(Plasmid Purification (Mini-prep)) TIP 대장균(Escherichia coli, E. coli)로 부터의 플라스미드 DNA(Plasmid DNA)분리는 연구실험에서 많이 알려져 있다. Mini-prep이라 불리는 Alkaline lysis method을 이용하여 Plasmid DNA을 빠르고 쉽게 추출하자. plasmid DNA 분리 방법 plasmid DNA분리는 주로 miniprep이라고 부르는 방법으로 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다. 플라스미드를 정제는 total cell DNA를 일반적인 분리방법과 같다. 플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면 된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다. 그러나 totall cell DNA 분리.. Engineering/화학생물공정 2022. 9. 24. 생명과학실험 | pGal을 활용한 대장균 형질전환 TIP Plasmid DNA에 의한 박테리아 형질전환을 할 수 있으며 파란색의 박테리아 콜로니의 존재로 Lac+형질을 설명하는 것이다. 박테리아의 형질 전환 박테리아의 형질전환은 박테리아 세포 내로 플라스미드 DNA를 투입해주는 작업을 의미한다. 세포가 세포막을 통해 외부 DNA를 직접 받아들이고, 형질 도입 및 접합을 통해 박테리아의 형질 전환이 일어난다. 실험 방법 1. 실험 과정 형질 전환 실험 전, LB Agar 플레이트 준비 및 대장균 소스 플레이트 준비 과정이 필요하다. 각각의 과정은 다음과 같다. 1) LB Agar 플레이트 준비 ① 고체 ReadyPour LB Agar를 누르고 흔들어 작게 부순다. ② 뚜껑을 일부 열어 가열되는 동안 수증기가 빠지지 않도록 한다. ③ 전자레인지에 60초간 .. Biology/생명 과학 | 공학 2022. 3. 1. 일반생물학실험 | Gene Cloning Gene cloning 생물체의 특정 유전자를 세포에서 추출한 후 그 유전자를 벡터 DNA에 삽입하고 Competent Cell에서 증식시킴으로써 균일한 유전자 집단을 생성하는 기술이다. DNA preparation, Insert DNA PCR, 제한효소 처리, Ligation, Transformation의 5가지 과정을 거쳐 진행된다. 먼저 원하는 유전자가 삽입될 플라스미드를 준비하기 위해 대장균을 배양한 후 Alkaline lysis를 이용해 균을 높은 pH에서 강한 음이온 세정제인 SDS로 처리하여 세포벽을 파쇄한다. 이때 염색체 DNA와 단백질, 깨진 세포벽 등은 SDS와 함께 침전되어 가라앉고 플라스미드 DNA는 용액 속에 유리되는데 이들을 원심분리하여 상층액으로부터 플라스미드 DNA를 분리 정.. Biology/일반 | 세포 생물학 2021. 7. 4. 생명과학실험 | DNA cloning와 전기영동 플라스미드(Plasmid)는 환상 DNA 분자들이며 독자적으로 염색체를 복제할 수 있고, 또 크기는 세균성 염색체 크기의 0.05-10%에 해당한다. 세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA로, 고리 모양을 띠고 있으며 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니며 또 플라스미드는 다른 종의 세포 내에도 전달된다. 이러한 특성을 이용하여 플라스미드는 유전공학에 폭넓게 이용되고 있다. cDNA는 Complimentary DNA, 즉 상보적 DNA란 뜻이며, mRNA를 주형으로 하여 상보적인 DNA (cDNA)를 합성하는 효소인 Reverse Transcriptase를 mRNA에 A, T, C, G와 함께 첨가하여 적정 환경에 놓아두면 cDNA가 합성된다. 우선 mRNA를 r.. Biology/생명 과학 | 공학 2020. 9. 13. 생화학실험 | Plasmid DNA isolation from bacterial cell - miniprep 실험 방법 1. 실험 과정 1) 미리 배양한 대장균 (E.coli) 세포 1.9㎖을 2㎖ tube에 넣고 13,000rpm으로 10분간 원심분리 한 후 상등액은 버린다. 2) 남은 용액은 Micro pipette으로 제거하고 Cell 덩어리를 얻는다. 이때 배지 성분이 남아있지 않도록 pipette으로 배지를 완전히 제거한다. 3) Cell이 들어있는 2㎖ tube에 S1 solution 250㎕을 넣고 pipetting한다. 4) S2 solution 250㎕을 넣고 조심스럽게 3～4번 inverting을하고 2분간 방치한다. 5) S3 solution 350㎕ 조심스럽게 inverting 한다. 6) 10분간 원심분리 한 후 plasmid purification tube에 상등액을 붓는다. 이때 pi.. Biology/생화학 2020. 9. 5. 일반생물학실험 | 제한효소에 의한 plasmid DNA 절단 - 전기영동 TIP 전기영동의 원리를 이해하고, 직접 시험관 내 plasmid DNA를 전기영동하여 본다. 제한효소를 이용한 DNA의 절단 및 붙이기 제한효소 1 unit는 1 ㎍의 DNA를 최적 온도에서 한 시간에 절단할 수 있는 양이다. 상품화된 효 소는 효소마다 다르지만 대개 10 units/㎕ 내외의 농도로 공급된다. 제한효소 처리 반응은 절단하 려고 하는 DNA, 반응완충용액, 제한효소로 구성된다. 각각의 성분에 대하여 다음과 같은 점들을 고 려해야한다. ① 자를 DNA 내에 제한효소로 잘리는 부위가 몇 개가 되는지 파악한다. 같은 양의 DNA에 제한효소 절단부위가 무수히 많을 수도 있고 없을 수도 있으며, 이들 경우에 같은 양의 효소작용을 기대할 수 없을 것이다. 그러나 보통 실험에서는 계산된 양보다 더 .. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 8. 26. 일반생물학실험 | 제한효소에 의한 DNA의 절단 TIP 1. 시험관 내에서 유전자를 조작할 때 쓰이는 도구인 제한효소로 Plasmid DNA를 잘라보고 분석한다. 또한 절단한 Vector DNA와 insert DNA를 ligase로 ligation해보고 대장균에서 그 형질을 발현 시켜 본다. 2. 생명공학의 기초가 되는 분자생물학의 기본실험인 미생물에서의 plasmid DNA를 절단하는 실험이다. 본 실험은 가장 기초가 되는 실험으로서 이 후에 하게될 전기영동 실험에서 응용하게 된다. 전기영동 실험에서는 거대분자들을 연구하기 위하여 사용하는 방법으로 PCR도 사용하게 된다. 이 실험을 통하여 DNA의 분리 및 확인을 알아보려고 한다 제한효소 (restriction enzyme) 제한효소 (restriction enzyme) 혹은 제한 내부핵산 가수분해.. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 8. 21. 일반생물학실험 | DNA work TIP 세균의 세포벽을 파괴하고 plasmid DNA를 분리한다. 분리한 plasmid DNA를 형질전환을 시키고 배지에서 키운다. 배지에서 키운후 제한효소를 이용해 잘라낸뒤 전기영동을 시켜서 관찰한다. 미생물학 실험을 수행하는 데 있어서 가장 기본이 되는 재료가 DNA이므로 많은 양의 DNA를 확보하는 것이 무엇보다 중요하다. 이를 수행하기 위해 외부 DNA를 숙주 세포 내로 도입시키는 방법인 형질전환(Transformation)을 이용하는데 이 방법은 박테리아 세포에 물리적 내지는 화학적 자극을 주어 Plasmid DNA를 받아들일 수 있는 상태로 만들어, DNA가 세포 내로 들어가게 한 다음, 이들 형질전환 된 세포들을 배양함으로써 이루어진다. 이처럼 DNA를 다량으로 얻는 것 이외에도 Librar.. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 5. 27. 생화학실험 | Purification of Plasmid DNA TIP Bacteria의 plasmid에 대해 알아보고 DNA의 구조에 의한 추출 원리를 이해한다. Plasmid 세균세포내에서 염색체와 독립적으로 존재하며 증식할 수 있는 환형DNA. 모든 플라스미드는 복제 개시점이 될수 있는 적어도 한 개의 DNA염기서열을 가지며 큰 플라스미드는 자체에 복제 효소를 가지기도 한다. 세균의 생존에 필수적인 유전정보를 가지고 있는 것은 아니지만 플라스미드에서 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자,세균의 자웅을 결정하는 성결정인자등이 발견되고 있다. 제한효소로 고리를 끊은 뒤, 진핵생물의 DNA를 삽입하여 잡종 플라스미드를 만들어도 세균안에서 정상적으로 작동하고 증식하며, 이를 이용한 유전자 재조합을 통해 유용한 단백질을 얻을 수 있다. Vector 필요한 유전자를 잘라내어.. Biology/생화학 2020. 5. 19. 유전학실험 | subcloning I(digestion) TIP 우리가 확인하고자 하는 promoter의 활성을 측정하기 위한 실험과정중 하나로써, 이미 vector에 붙어있는 promoter에서 일부분을 자르기 위해 vector를 restriction enzyme(restriction endonuclease)을 이용하여 잘라낸 후 그 크기들을 확인한다. 1. genomic DNA와 plasmid DNA의 차이 2. subcloning 3. electrophoresis 4. restriction enzyme 5. promoter gene & reporter gene 실험 방법 1. 실험 과정 1) plasmid DNA인 pMB01을 준비한다. 2) Microfuge tube에 DDW 12.5㎕, DNA(pMB01) 5㎕, enzyme(BamHI)을 일정량 넣고.. Biology/유전학 2019. 10. 24. 분자유전학실험 | 알칼리 세포파괴 방법에 의한 플라스미드 DNA의 분리 TIP 1. Plasmid DNA 2. Plasmid DNA 분리 3. RNA is structurally very similar to DNA. How can you remove RNA during plasmid isolation? 4. How do you break the cell membranes? 5. What is the role of ethanol in the current experiment? 6. How do you determine the concentration of the plasmid isolated using UV/Vis spectrometry? 7. 실험 기구 및 시약 8. 실험 방법 Plasmid DNA 염색체 밖에 존재하는 DNA이다. plasmid DNA는 그 자체 내에 re.. Biology/유전학 2019. 9. 4. 이전 1 다음 반응형
