잘 제조된 의약품이라고 해도 분석한 데이터를 신뢰할 수 없다면 의약품의 제조 자체가 무의미해져 버립니다. 예를 들어 어떤 의약품의 함량을 50mg으로 예상하고 제조 공정을 진행한 후 실제 그 의약품을 분석해 봤을 때 40mg이 나왔다면 그 의약품은 잘못 제조된 것입니다. 하지만 40mg이라고 분석된 그 분석법을 신뢰할 수 없다면 제조된 의약품의 적합 여부와 판매 또는 폐기 여부를 판별할 수 없게 됩니다. 이렇듯 분석법의 신뢰 여부는 매우 중요한 문제입니다.
1. 시험 방법 밸리데이션의 정의 및 관련 규정
시험 방법 밸리데이션은 무엇일까요? 시험 방법 밸리데이션은 분석법 밸리데이션이라고도 하는데요. 의약품 등의 품질관리를 위해 시험방법의 타당성을 미리 검증하고 문서화하는 것으로 품목별로 실시합니다. 이러한 시험 방법 밸리데이션을 규정에 따라 진행하는 것은 매우 중요한데요. 시험 방법 관련 규정은 ICH Q2(Validation of Analytical Procedures : Text and Methodology와 의약품 등 밸리데이션 실시에 관한 규정(식약청고시, 2008), 의약품 등 시험방법 밸리데이션에 대한 가이드라인 적용을 위한 해설서가 있습니다.
시험 방법 밸리데이션을 실시해야 하는 시험 방법은 5가지가 있는데요. 그것은 원료 규격이 설정된 화학적 합성의약품 등에 대한 확인시험, 순도시험 중 불순물의 정량 시험, 순도시험 중 불순물의 한도 시험, 유효성분 또는 기타 특정 성분에 대한 함량 또는 역가시험, 유효성분 또는 기타 특정 성분에 대한 함량균일성 시험입니다.
2. 시험 방법 밸리데이션의 파라미터(Parameter)
파라미터(Parameter)는 시험 방법 밸리데이션의 적절성 여부를 판별하게 하는 것으로 특이성 (Specificity) 직선성(Linearity), 범위(Range), 정확성(Accuracy), 정밀성(Precision), 검출 한계(Detection limit), 정량 한계(Quantizataion limit), 완건성(Robustness)이 있습니다. 그럼 각각의 파라미터에 대해 좀 더 자세히 알아보도록 할가요?
먼저 특이성(Specificity)은 불순물, 분해물, 배합성분 등이 혼재되어 있는 상태에서 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력입니다. 이러한 특이성(Specificity)에는 확인 시험, 순도 시험, 정량 시험이 있는데요. 확인 시험은 분석대상물을 실수없이 확인할 수 있는 능력을 의미하고, 순도 시험은 시료 중의 불순물 함량을 정확히 나타내는 능력이며, 정량 시험은 시료 중의 분석대상물 함량 또는 역가를 정확히 나타내는 능력을 의미합니다.
특이성(Specificity)이 무엇인지 예를 들어 살펴볼까요? 만약 불순물 사이에 원하는 분석물질이 섞여 있어 전혀 분간을 할 수 없다면 그것은 특이성(Specificity)이 없다고 볼 수 있는데요. 특이성 (Specificity)이 있으려면 다음처럼 불순물(Impurities)사이에 원하는 분석물질(Analyte)을 정확히 구분할 수 있어야 합니다. 그런데 때로는 어떤 것을 특이성(Specificity)이 있다고 불러야 할지 애매한 경우가 있습니다. 대한 약전 기체 및 액체크로마토그래프법에서는 특이성의 여부를 판단할 때 분리도라는 개념을 사용 합니다.
분리도는 피크분리의 기준으로 이용하는데요. 대한약전에서는 분리도 1.5 이상을 특이성이 있다고 부르고 있습니다. 만약 분리도가 이보다 낮을 경우에는 타당한 근거자료를 제시하여 특이성을 입증할 수 있습니다. 순도 시험에서는 크로마토그램 상 분석대상물의 피크가 여러 성분에서 유래되지 않았음을 입증하기 위해서 포토다이오드어레이(PDA)나 질량분석기(MS) 등을 검출기로 사용하여 피크의 단일성 여부를 확인할 수 있습니다.
직선성(Linearity)은 실험 방법이 일정범위에 있는 검체 중 분석대상물질의 양 또는 농도에 대하여 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력입니다. 이러한 직선성(Linearity)은 서술되는 시험 방법의 모든 범위에서 입증하여야 하는데요. 이를 위해서는 표준원액을 농도별로 희석하여 최소한 5개의 농도로 각 농도에 대해 직선성이 있다는 것을 증명해야 합니다. 직선성(Linearity)을 평가할 때는 절편, 회귀직선의 기울기, 전체 제곱의 합 등 파라미터를 제시하여 평가합니다.
직선성(Linearity)의 예를 살펴볼까요? 직선성(Linearity)의 판별은 검량선을 그려 식을 구한 다음 R의 제곱의 값으로 판별합니다. 다음과 같이 AAP(아세트아미노펜)를 UV Spectrophotometer로 분석할 경우 X축은 농도, Y축은 흡광도로 표현될 수 있으며, R의 제곱의 값이 1에 가까울수록 직선성이 있다고 할 수 있습니다.
범위(Range)는 시험 방법이 적절한 정밀성, 정확성 및 직선성을 충분히 제시할 수 있는 검체 중 분석대상물질의 양 또는 농도의 하한 및 상한값 사이의 영역입니다. 이러한 범위(Range)는 규정하는 범위 내 또는 그 범위의 양단의 농도를 포함한 검체를 이용하여 시험 방법의 직선성, 정확성 및 정밀성을 확인함으로써 타당성을 입증할 수 있습니다. 범위(Range)는 의약품 분석에서 시험 방법에 따라 최소로 규정하는 범위가 있습니다. 정량 시험의 경우에는 일반적으로 시험 농도의 80～120%, 함량균일성 시험의 경우에는 #2 시험 농도의 70～130%, 용출 시험의 경우에는 제제의 기준 및 시험 방법 중 설정된 용출 시험기준 범위의 ±20%를 그 범위(Range)로 규정하고 있습니다.
정확성(Accuracy)은 측정값이 이미 알고 있는 참값이나 표준값에 근접한 정도로서 실측치가 참값에 얼마나 가까운가를 의미하는 것입니다. 이러한 정확성(Accuracy)을 검토할 때는 정확성(Accuracy)을 규정하는 범위를 포함하는 최소한 3개 값의 농도에 대하여 시험방법의 전체 조작을 최소 9회 반복하여 측정한 결과로 평가해야 합니다. 예를 들면, 3개 값의 농도에 대해 시험방법의 전체 조작을 각 농도별로 3회씩 반복하여 측정하는 것입니다.
정밀성(Precision)은 균질한 검체로부터 여러번 채취하여 얻은 시료를 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 각각의 측정값들 간의 근접성(분산정도)을 나타내는 것으로 종류는 반복성(병행정밀성, repeatability, intra-assay precision), 실험실내 정밀성(intermediate precision), 실험실간 정밀성(재현성, reproducibility)이 있습니다.
반복성(병행정밀성, repeatability, intra-assay precision)은 단시간 사이에 동일 조건 하에서 측정하는 정밀성이고, 실험실내 정밀성(intermediate precision)은 동일 실험실내에서 실험일, 시험자, 기구, 기기 등을 바꿔 측정하는 측정값 간의 정밀성입니다. 그리고 실험실간 정밀성(재현성, reproducibility)은 하나의 균일한 검체에서 채취한 시료를 서로 다른 실험실 간에 측정하는 정밀성입니다.
의약품의 품질관리를 위한 시험은 일반적으로 하나의 실험실에서 실시되는 경우가 많으므로 통상적으로 반복성(병행정밀성, repeatability, intra-assay precision)과 실험실내 정밀성(intermediate precision)을 검토하면 됩니다. 정밀성(Precision)의 평가는 일반적으로 분산, 표준편차 또는 상대 표준편차로 나타내는데요. 평가 방법은 규정하는 범위를 포함한 3농도에 대해 시험 방법의 전 조작을 각 농도당 3회씩 반복하여 측정하는 방법이 있고, 시험농도의 100 %에 해당하는 농도에서 시험방법의 전 조작을 적어도 6회 반복하여 측정하는 방법이 있습니다.
일반적으로는 정확도(Accurate)와 정밀도(Precision)가 어떻게 다른지 그 차이를 구분할 수 없는 경우가 많은데요. 만약 어떤 양궁선수가 10점 만점인 과녁에서 10점을 맞추지 못하고 4점 근처 영역을 집중적으로 맞춘다고 해 봅시다. 이때 사수는 10점을 맞추는 것이 목적이므로 그 목적에 부합되어 정확하다고 볼 수 없지만 4점 영역은 계속 맞출 수 있으므로 정밀하다고는 볼 수 있는 것입니다.
야구에서도 마찬가지입니다. 투수가 계속 같은 곳으로 공을 던질 수 있지만 그 지역이 스트라이크존이 아닌 볼 구역이라면 그 투수는 계속 볼넷을 허용하게 될 것입니다. 투수의 목적은 스트라이크를 던져 상대방 선수를 삼진시키는 것이 목적이므로 이 투수는 좋은 투수라고 할 수 없습니다.
마찬가지로 의약품의 분석에서 정밀도도 중요하지만 정확하지 않은 정밀도는 의미가 없습니다. 정확도는 매우 중요한 파라미터라고 할 수 있는 것입니다. 검출 한계(Detection Limit)는 검체 중에 존재하는 분석대상물질에서 검출 가능한 최소량을 의미합니다.
이러한 검출 한계(Detection Limit)의 평가 방법은 시각적 평가에 근거하는 방법, 시그널 (signal) : 노이즈(noise)에 근거하는 방법, 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법이 있습니다. 시각적 평가에 근거하는 방법은 검출 한계(Detection Limit)에 가깝다고 생각되고, 이미 알고 있는 양의 분석대상물질을 함유하는 시료를 반복 분석하여 분석대상물질이 확실하게 검출 가능하다는 것을 확인한 후 이것을 검출 한계(Detection Limit) 로 설정하는 방법입니다. 시그널 (signal) : 노이즈(noise)에 근거하는 방법은 시그널(signal) : 노이즈(noise)의 비율을 3 : 1 또는 2 : 1로 검출 한계(Detection Limit)를 설정하는 방법입니다. 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법은 DL = 3.3σ/S로 검출 한계를 설정하는 방법입니다. 여기에서 σ는 반응의 표준편차, #2 S는 검량선의 기울기를 의미합니다.
검출 한계(Detection Limit)와 정량 한계(Quantitation limit)의 평가 방법은 매우 유사하므로 주의하시기 바랍니다. 검출 한계(Detection Limit)와 정량 한계(Quantitation limit)가 어떤 차이가 있는지 한번 살펴볼까요? 다음에서 검출 한계(Detection Limit)와 정량 한계(Quantitation limit)의 차이를 알 수 있는데요.
여기에서 시그널(Signal)이란 원하는 분석물질의 값을 의미하고, 노이즈(Noise)는 검체 기기에서 자체적으로 발생하는 Baseline을 의미합니다.
완건성(Robustness)은 시험법 중 일부 조건이 소규모라도 의도적으로 변경되었을 때 측정값이 영향을 받지 않는지에 대한 척도이고, 분석법이 통상 사용되는 동안 그 분석법이 얼마나 신뢰할 수 있는지에 대한 지표입니다. 이러한 완건성(Robustness)은 표준화된 시험방법에서 시험조건을 변동할 수 있도록 설정해 놓은 범위보다 더 넓은 범위를 의도적으로 변동시켜서 검토하게 되며, 표준분석법 시험조건의 변동폭보다 더 넓은 범위를 고의로 변동하여 실행합니다. 완건성(Robustness)의 평가에는 여러 가지 변동인자가 사용되는데요. 시험방법에 공통되는 변동인자는 시험용액의 안정성과, 추출시간입니다. 그리고 액체크로마토그래프법의 대표적인 변동인자는 pH, 조성 등의 이동상, 칼럼의 변경, 온도, 유량이고, 기체크로마토그래프법의 대표적인 변동인자는 칼럼의 변경, 온도, 유량입니다.
3. 시험 방법 재 밸리데이션의 적용
시험 방법 밸리데이션에서 재 밸리데이션을 시행해야 하는 경우가 있습니다. 재 밸리데이션의 시행 여부를 검토해야 하는 경우는 주성분의 제조원 또는 제조방법을 변경하는 경우, 제제의 조성을 변경하는 경우, 시험 방법을 변경하는 경우, 시스템적합성 시험에 부적합한 경우, 제품 자체에는 문제가 없으나 시험결과가 품질 관리 기준에 부적합한 경우가 있습니다.
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