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  생화학실험 | pH와 완충용액 - pH and Buffer Solution TIP pH 미터기의 사용법을 숙지하여 pH를 측정한다. 여러 완충용액을 만드는 법을 알고 완충용액의 pH와 변화한 pH를 pH미터기로 측정한다. Handerson-Hasselbalch 식을 이용하여 pH를 계산한다. pH의 측정 Henderson-Hasselbalch 식을 이용해서 pH를 간단하게 계산할 수 없는 복잡한 수용액의 pH를 정확하게 측정하기 위해 pH meter를 이용한다. 요즈음 판매되는 pH meter의 대부분은 기준 전극과 pH 의존형 전극이 함께 하나의 유리나 플라스틱 튜브에 들어있는 복합 전극으로 이루어져 사용이 편리하나 다음과 같은 사항은 꼭 주의하여 사용하여야 한다. pH meter를 사용하지 않을 때는 꼭 대기(stand by) 상태로 두어야하고, 사용하기 전에 반드시 전극 .. Biology/생화학 2020. 6. 22.

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  생화학실험 | pH와 완충용액 TIP 1. 몰의 농도를 이해하고 용액 조제에 활용할 수 있다. 2. 플라스크와 피펫을 이용하여 산, 염기 시약으로 용액조제를 할 수 있다. 3. 조제한 각 용액의 pH를 pH paper와 pH Meter기로 측정할 수 있다. 4. 물과 Acetate buffer에 두 방울씩 NaOH를 더하고 용액을 두 방울씩 빼면서 물과 완충용액의 pH변화를 측정하여 완충능력을 비교할 수 있다. 완충용액 산이나 알칼리를 첨가해도 pH의 변화가 적게 나타난다. 이를 완충작용이라 하 며 이러한 능력이 있는 용액을 완충용액(buffer solution)이라고 한다. 완충용액의 능력은 완충용액의 농도(완충용액을 이루는 약산과 그 짝염기의 몰 농도의 합)와 약산과 짝염기의 비율에 따라 달라진다. 완충용액의 능력은 약산과 그 짝.. Biology/생화학 2020. 6. 15.

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  생화학실험 | 완충용액 만들기 및 pH 측정 TIP 1. 여러 가지 지시약의 변색 범위를 이용하여 실험을 통해 얻은 완충용액의 pH를 측정할 수 있다. pH 미터기를 이용하여 pH 변화를 관찰하고 농도 변화와 pH관계를 적정곡선으로 나타낼 수 있다. 2. 또한 pH의 이론값과 실제 실험 값을 비교해 보고 그래프로 나타낸다. 3. 지시약을 통해 pH를 측정해본다. 수소이온농도 pH란 용액 1L 속에 존재하는 수소 이온의 몰수를 의미하며 물질의 산성, 알칼리성의 정도를 나타내는 수치로, 수소 이온 활동도의 척도이다. 체내 반응은 수소이온농도, 즉 pH에 따라 그 반응이 진행되기도 하고 비활성화 되기도 하며, pH가 맞지 않는다면 생명체는 치명적인 위험에 처하기도 한다. 이를 이해하기 위해 두 가지 종류의 완충용액을 제조하고 각종 방법을 이용한 pH측정.. Biology/생화학 2020. 6. 11.

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  생화학실험 | 단백질 정량 분석 - BCA법 & SDS-PAGE 분석 & Western Blot TIP BCA Method를 이용하여 우유 중의 단백질 함량을 분석하고 SDS-PAGE와 Coomassie Blue 염색을 통해 단백질의 전기영동 결과를 관찰한 것을 바탕으로 Western Blot을 시행하여 membrane에 transfer시켜, 항원-항체 반응을 이용하여 특정한 단백질의 정량 분석과 검출하는 방법을 실험을 통해 숙지한다. 실험 방법 1. 단백질 정량분석-BCA법 1) Sample & stardard 제조 ➀ 우유 속에는 약 5%의 단백질이 들어 있고, 1㎖속의 우유에는 약 50㎎이 들어 있는데, BCA법의 정략정 단백질 양 범위는 20～2000μg/㎖이므로 이를 1/100으로 희석하여 Epp. tube에 담았다. ➁ Albumin Standard Ampules의 농도는 2.0㎎/㎖이기.. Biology/생화학 2020. 6. 7.

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  생화학실험 | Absorption Spectra TIP 분광광도계를 이용한 흡수 스펙트럼을 관찰해 본다. 분광광도계 분광광도계는 크게 광원, 단색화 장치, 검출기로 구성되어 있다. 광원에는 텅스텐 램프(320-2500㎚영역의 복사선), 중수소 아크 램프(200-400㎚영역의 자외선), 글로바(4000-200 의 적외선 복사선), 헬륨-네온 레이저(638㎚), 레이저 다이오드(680-1550㎚의 근적외선) 등이 있다. 단색화 장치는 빛을 각성분 파장으로 분산시키고 좁은 띠의 파장을 선택하여 시료 또는 검출기로 보낸다. 검출기는 광자가 검출기에 도달할 때의 전기 신호가 발생하는 원리를 이용하여 전류의 세기와 복사세기가 비례한다는 사실을 이용하여 흡광도를 측정한다. wavelenght range[㎚] color(absorbed) color observed .. Biology/생화학 2020. 6. 1.

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  생화학실험 | Western Blotting - SDS-Page TIP 1. 단백질을 크기별로 분리하는 기술로 항원-항체 반응을 이용하여 전체 단백질에서 특정 단백질만을 Detection 할 수 있다. 2. 본 Western Blotting은 뉴런으로 분화하기 전인 Neuroblastoma(Ne,신경모세포)를 사용해 신경모세포가 암이 되게 유발하는 단백질을 찾을 수 있다. Gel electrophoresis에 대한 세부적인 이론이 복잡하고 현재로서는 불완전할지라도, 그 기본적인 개념은 쉽게 이해될 수 있다. 간단히 말해서 전기영동 분석은 전하를 띤 입자들이 외부에서 공급된 전기장의 영향을 받아서 반대 부호를 가진 전극 쪽으로 이동하는 데서 기인한다. 입자들의 움직임은 주위의 molecular sieve로서 역할을 하는 gel matrix와의 상호작용에 의해 지연된다... Biology/생화학 2020. 5. 28.

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  생화학실험 | Western Blot TIP 항원에 대한 항체의 특이적 결합을 이용하여 단백질 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 분석하는 western blot의 원리를 이해하고, 단백질의 SDS-PAGE분리, 단백질의 gel로부터 membrane으로의 transfer, 항체반응 및 항체에 부착된 효소의 반응에 의한 발색반응 등의 실험기법을 습득한다. Immunoblot(western blot)의 원리 immuno blot이라고도 부르는 western blot은 antigen과 antibody사이의 특이적인 결합을 이용하여 시료 속에 위치한 단백질을 정성적/정량적으로 분석하는 방법이다. 단백질이 transfer되어있는 membrane에 원하는 단백질의 antibody를 넣어주면 항원 항체반응을 일으켜 antibody가 원하는 단백질 band에.. Biology/생화학 2020. 5. 26.

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  화학공학실험 | Electrophoresis - 전기영동 TIP 단백질의 기본적인 개념과 단백질의 분리정제에 대해서 이해하고, 단백질의 분리의 가장 일반적인 방법인 1-D 전기영동 실험을 이용하여 목적하는 단백질의 분리 및 단백질체학(proteomics)의 기본적인 지식을 배양하도록 한다. 실험 방법 1. Casting & Running (Denaturing SDS-PAGE) ① 전기영동 키트의 고유한 방법에 따라 유리판을 casting한다. ② Stacking gel과 running gel 용액을 준비한다. Ⓐ Stacking gel과 running gel 모두 부족할 때를 대비 하여 충분히 만든다 Ⓑ Running gel은 15%, Stacking gel은 5%가 되게 만든다. ③ Running gel 용액에 ammonium persulfate와 TEMED.. Engineering/화학 공학 | 단위조작 | 유체역학 2020. 5. 24.

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  생화학실험 | Plasmid DNA Purification Plasmid는 bacteria 세포의 염색체와는 별도로 존재하면서 self-replication을 할 수 있는 원형 DNA 분자로 적은 수의 gene을 가지고 있다. 이 plasmid는 유전자 재조합 시 재조합 DNA 조작을 위한 vector DNA(숙주에 이종의 DNA를 운반하는 DNA)로 사용되며 원하는 DNA 단편을 넣어 gene cloning 등에 널리 이용된다. Plasmid는 주로 대장균 세포에서 증식되며 vector DNA로 사용되기 위하여 대량 증식된 대장균 세포로부터 분리하여 사용하게 되는데 대장균 세포내에서 염색체와는 별도로 존재하기 때문에, plasmid DNA 분리는 염색체 DNA가 포함되지 않게 분리하는 방법이 사용되게 된다. 이러한 분리 방법 중 널리 사용되는 방법 중 하나가 .. Biology/생화학 2020. 5. 23.

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  생화학실험 | Purification of Plasmid DNA TIP Bacteria의 plasmid에 대해 알아보고 DNA의 구조에 의한 추출 원리를 이해한다. Plasmid 세균세포내에서 염색체와 독립적으로 존재하며 증식할 수 있는 환형DNA. 모든 플라스미드는 복제 개시점이 될수 있는 적어도 한 개의 DNA염기서열을 가지며 큰 플라스미드는 자체에 복제 효소를 가지기도 한다. 세균의 생존에 필수적인 유전정보를 가지고 있는 것은 아니지만 플라스미드에서 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자,세균의 자웅을 결정하는 성결정인자등이 발견되고 있다. 제한효소로 고리를 끊은 뒤, 진핵생물의 DNA를 삽입하여 잡종 플라스미드를 만들어도 세균안에서 정상적으로 작동하고 증식하며, 이를 이용한 유전자 재조합을 통해 유용한 단백질을 얻을 수 있다. Vector 필요한 유전자를 잘라내어.. Biology/생화학 2020. 5. 19.

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  생화학실험 | 형질전환 - 대장균 DNA 전기영동 관찰 형질전환 형질전환(transformation)은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적 성질을 변하게 하는 일을 말한다. 이는 1928년 영국의 그리피스가 Diplococcus pneumonia를 이용하여 실험한 것이 계기가 되어 발견된 실험 방법이다. 세포는 외부의 DNA를 받아들임으로써 원래 갖고 있는 성질과는 다른 새로운 유전형질을 발현할 수 있게 된다. Transformation 에서는 외부의 DNA를 벡터를 이용해 bacteria cell에 주입해 준다. 이러한 벡터를 이용한 외부 DNA를 세포에 주입하는 방법으로는 또한 Transfection이 있다. Transfection은 Transformation과 같이 외부 DNA를 세포에 주입한다는 것은 같지만 가장 큰 차이점으로 Transf.. Biology/생화학 2020. 5. 15.

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  생화학실험 | 다당류의 구조 분석 및 아이오딘 산화(Periodate Oxidation) 반응 TIP 아이오딘 산화(Periodate Oxidation)반응을 이용하여 단당류와 이당류의 농도를 계산하고 다당류(Glycogen)의 1차적 구조를 알기 위한 것이다. 아이오딘 산화(Periodate Oxidation) 반응 반응시료가 아래와 같을 때 periodate(NaIO4)와 반응하면 산화와 탄소-탄소 결합의 분해를 동시에 가져온다. 두 개의 하이드록실기가 이웃하거나 한 개의 하이드록실기가 알데히드 또는 케톤과 이웃하고 있을 때, 각각의 알데히드와 케톤과 동적평형을 이루는 당의 헤미아세탈과 헤미케탈은 알데히드와 케톤처럼 작용한다. 실험 방법 1. 실험 과정 1) 실험 진행 일주일 전 ① 100mM Glycerol 10㎖를 정확히 재서 10㎖의 0.4M NaIO4 용액을 넣고 Parafilm으로 s.. Biology/생화학 2020. 5. 12.

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  생화학실험 | Protein quantification by DC protein assay DC (Detergent Compatible) protein assay 본 반응은 Lowry assay와 거의 동일한 원리로 진행된다. 단백질과 alkaline copper tartrate solution 사이의 반응이 일어나고, 이때 생성된 copper-treated protein이 foline 시약에 의해 환원되면서 푸른 색 변화를 보인다. 이는 단백질 농도에 따라 750㎚ 에서 최대 흡광도를 보이면서 단백질 양을 측정할 수 있다. 1. 장점 및 단점 본 실험은 계면활성제가 용해된 상태에서 진행하는 비색성 정량법(colorimetric assay)으로, 계면활성제 존재에 따른 실험값의 추가적인 보정이 필요 없다. 또한 15분 내에 최대 색 변화의 90% 이상 진행되므로 시간을 절약할 수 있다. 시약의.. Biology/생화학 2020. 5. 9.

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  생화학실험 | RNA polymerase 분리 정제 실험 방법 1. 실험 과정 1) Cell lysis ① pellet을 녹인 후 Buffer LB 26㎖ 분주하여 섞는다. ② 잘 섞은 pellet을 ice에 박혀있는 비커에 붓고 stirring하여 6㎖ lysozyme에 분주한 다음, 66㎖ PMSF와 33㎕ leupeptin도 첨가한다. (20min 반응시간 준다.) ③ 20min 후, 3㎖ 0.8% Sodium deoxycloate 첨가하고 20min 반응 시간 준다. ④ 20min 후, 50㎕ PMSF 첨가하고 5.6㎖ 2M Ammonium Sulfate 첨가한다. ⑤ Total volume 56㎖ 까지 Buffer LB를 첨가한다. ⑥ 5.6㎖ 10% PEI를 아주 천천히 넣어주고 20 min 반응시간 준다. ⑦ 39.00g 4도에서 15min .. Biology/생화학 2020. 5. 5.

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  생화학실험 | UV-VIS KMnO4 극대 흡수 파장 측정 TIP UV-Vis의 기기 사용방법을 습득하고 특급 시약으로 조제한 용액의 흡광도를 측정하여 KMnO4의 극대 흡수 파장을 구한다. Beer-Lambert Law 빛의 투광도는 시료의 농도와 특별한 상관관계를 나타내지 않지만 그 로그함수는 다음과 같이 시료의 농도와 일정한 상관관계를 나타낸다. - log T = K×C C : 시료 중의 흡광물질의 농도, K: 상수 위의 식에서 -log T를 흡광도(absorbance,A)라고 함으로 흡광도는 시료의 농도와 특별한 상관관계를 지니게 된다. A = K×C 위의 A = KC의 관계를 Beer's law라고 한다. 하지만 시료의 흡광도는 위에서 설명한 시료중의 흡광 물질의 농도에 의해서만 결정되지 않는다. 즉, cuvette의 직경 또는 폭에 따라서 흡광도는 달.. Biology/생화학 2020. 5. 2.

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  생화학실험 | GPC 기법을 이용한 단백질 분리 및 미지시료의 분자량 측정 TIP 액체에 용해되어 있는 혼합물의 각각의 분자량의 차이를 이용해서 분리하는 방법 중 대표적인 방법은 다공성 입자를 충진한 column을 이용하는 것이다. 아래 그림과 같이 여러 가지 분자량을 가진 용질이 용해되어 있는 용액을 충진 column의 윗부분에 투입한 후 용질이 함유되어 있지 않은 용매만을 coulmn에 공급하면 분자량이 큰 물질은 충진물질의 공극을 통과하지 않고 입자사이로 빠져나오게 되므로 column을 통과하는 시간이 빠르다. 반면에 분자량이 작은 물질은 입자의 공극을 돌아다니다가 빠져나오게 되므로 column을 통과하는 시간이 오래 걸린다. 이러한 분자량과 column의 통과시간 사이의 관계를 이용하면 시료의 분자량을 측정할 수 있게된다. Column을 통과한 단백질용액을 일정한 부피씩.. Biology/생화학 2020. 4. 28.

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  생화학실험 | UV-vis spectrophotometer와 standard curve TIP UV-vis spectrophotometer를 이용해서 시료의 흡광도를 측정하고 그에 따른 Standard curve를 이용하여 미지시료의 농도를 구하기 실험 방법 1. 실험 과정 1) 1mM의 ρ-nitrophenol을 각각 10, 20, 50, 100, 200μM 농도 1mL를 만든다. ρ-nitrophenol(㎕) DW(㎕) 10μM 10 990 20μM 20 980 50μM 50 950 100μM 100 900 200μM 200 800 2) 10μM나 20μM의 경우 10㎕나 20㎕의 피펫팅이 부정확할 수 있으므로 100μM용액에서 100㎕를 에펜 튜브에 넣고 DW 900㎕를 첨가하면 10μM의 시약을 얻을 수 있고, 20μM농도의 시약도 이 방법을 사용해서 제조할 수 있다. 3) 각각 만.. Biology/생화학 2020. 4. 18.

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  생화학실험 | Enzyme assay TIP 340㎚에서의 NADH 흡광도 변화를 통해 LDH 활성도를 확인 할 수 있다. Enzyme 각종 화학반응에서 자신은 변화하지 않으나 반응속도를 빠르게 하는 단백질을 말한다. 즉, 단백질로 만들어진 촉매라고 할 수 있다. 단백질로 이루어져 있기 때문에 무기촉매와는 달리 온도나 pH(수소이온농도) 등 환경 요인에 의하여 기능이 크게 영향을 받는다. 즉, 모든 효소는 특정한 온도 범위 내에서 가장 활발하게 작용한다. 대개의 효소는 35∼45℃에서 활성이 가장 크다. 하지만 온도가 그 범위를 넘어서면, 오히려 활성이 떨어진다. 온도가 올라가면 일반적으로 화학반응 속도가 커지고 효소의 촉매작용도 커지지만, 온도가 일정 범위를 넘으면 효소의 단백질 분자구조가 변형을 일으켜 촉매기능이 떨어지기 때문이다. 또한.. Biology/생화학 2020. 4. 14.