반응형 생화학실험 | 형질 전환 실험 개요 형질전환이란 외부에서 만들어진 plasmid를 plasmid가 없는 원핵 세포 cell에 넣어 그 원핵 세포가 본래 성질과는 다른 새로운 유전형질을 나타내게 하여 삽입한 plasmid를 대량으로 키우는 과정이다. 형질전환은 폐렴구균을 통해 DNA가 유전물질임을 PCR과 클로닝 등의 방법으로 증명했다. 인슐린의 경우 처음에는 돼지에게서 추출했지만 많은 수요에 비해 공급은 원활하지 못 했고 깨끗하지 않을 수도 있다는 의견 때문에 중지되었다. 그 후, 인간에게서 인슐린을 만드는 단백질(염기서열)을 찾아내어 인슐린을 공급할 방법을 개발해내었다. 형질전환에서 가장 필요한 것은 제한효소이다. 제한효소는 하등한 원핵세포들이 면역 작용을 하기 위해 가지고 있는 효소로 한 제한효소는 한 특정 염기서열을 잘라내.. Biology/생화학 2023. 10. 25. 보건환경미생물학실험 | Heterologous expression of the transformed gene TIP 형질전환된 미생물에서 plasmid에 의해 이형발현시켜, 생성된 단백질로 형질전환이 잘 되었는지 확인하고, 어떤 과정에서 잘못되었는지 점검하고자 한다. IPTG induction isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside의 약칭으로, lac operon 효소합성을 유도하는 강력한 유발물질이다. 비분해 비대사성이 유도물질이라 미생물이 합성을 계속 유도시킨다. lacZ gene에서 β-galactosidase 만들 때 필요하다. allolactose와 유사한 젖당유사체로서, inhibitor(repressor)와 결합하여, E. coli의 RNApolymerase가 lac promoter를 인식하도록 하여, T7 polymerase gene을 전사하도록 하는 역할을 담당한다.. Engineering/환경 | 토양 | 폐기물처리 공학 2022. 10. 10. 일반생물학실험 | 플라스미드 DNA 추출 TIP Recombinant DNA plasmid가 들어있는 E.coli로부터 plasmid를 직접 추출하여 분자생물학적 실험의 기본이 되는 DNA관련 실험에 대해 이해한다. 외부 DNA를 E.coli에 도입시켜 형질전환이 이루어지게 하면 이 세포들은 기존에 갖고 있던 chromosomal DNA 뿐만 아니라 plasmid DNA도 갖고 있게 된다. 특정한 DNA를 확보하고 싶을 때, 그 plasmid DNA를 숙주세포에 도입한 후, 따로 분리해내면 원하는 것을 얻을 수 있다. 이 실험에서 Ampicillin이 포함된 LB배지에서 키운 형질전환된 Ampicillin 저항성 E.coli를 이용하여 특정한 plasmid DNA를 얻는다. 실험 방법 1. 실험 과정 1) Ampicillin이 포함된 LB배지에.. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 9. 24. 일반생물학실험 | 형질 전환 - 박테리아 유전자 TIP 대장균의 형질 전환 실험을 통해 형질 전환의 원리와 개념을 이해한다. 형질 전환(Transformation) 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질(遺傳形質)을 변화시키는 현상. 형질 전환은 1928년 F. 그리피스의 폐렴균(肺炎菌)을 이용한 실험과 함께 알려졌다. 그리피스는 폐렴균 중에서 다당류(多糖類)로 이루어진 두꺼운 막(협막〈莢膜〉)을 갖는 병원성(病原性)의 세포(S형균이라 부른다)를 가열하여 죽인 다음, 같은 종의 균의 돌연변이체(突然變異體)로서 협막을 갖지 않는 비병원성 세포(R형균이라 부른다)와 섞어서 쥐에게 주사하여, 쥐는 발병(發病)해 죽고, 시체에는 열에 의해 죽었을 S형균이 출현하는 것을 발견하였다. 실험 방법 1. .. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 6. 19. 생명과학실험 | pGal을 활용한 대장균 형질전환 TIP Plasmid DNA에 의한 박테리아 형질전환을 할 수 있으며 파란색의 박테리아 콜로니의 존재로 Lac+형질을 설명하는 것이다. 박테리아의 형질 전환 박테리아의 형질전환은 박테리아 세포 내로 플라스미드 DNA를 투입해주는 작업을 의미한다. 세포가 세포막을 통해 외부 DNA를 직접 받아들이고, 형질 도입 및 접합을 통해 박테리아의 형질 전환이 일어난다. 실험 방법 1. 실험 과정 형질 전환 실험 전, LB Agar 플레이트 준비 및 대장균 소스 플레이트 준비 과정이 필요하다. 각각의 과정은 다음과 같다. 1) LB Agar 플레이트 준비 ① 고체 ReadyPour LB Agar를 누르고 흔들어 작게 부순다. ② 뚜껑을 일부 열어 가열되는 동안 수증기가 빠지지 않도록 한다. ③ 전자레인지에 60초간 .. Biology/생명 과학 | 공학 2022. 3. 1. 일반생물학실험 | Transformation - 미생물에서 재조합 단백질 발현 TIP E.coli의 transformation 실험을 통해서 유전 공학에 많이 쓰이는 transformation의 기작을 이해하고, 그 방법을 익힌다. 형질전환(TRANSFORMATION)형질전환이란 수용세포에 노출된 DNA가 흡수, 통합, 발현되는 과정을 나타내며 몇몇의 박테리아 사이에서 자연적으로 일어나는 현상이다 (예로 Stretococcus와 Bacillus). 대장균을 포함한 다른 종은 외부DNA를 흡수할 능력이 없다. 이러한 한계점을 극복하기 위해서 수용세포로 DNA를 삽입하기 위한 인공적인 방법이 고안되었고 수많은 실험생물에 적용되었다. 움직이게 할 수 있는 DNA의 2번째 방법인 형질전환은 1928년 Fred Griffith에 의해 발견되었다. 형질전환은 유전자 형태에서 수용성 C.. Biology/일반 | 세포 생물학 2021. 7. 20. 분자생물학실험 | Competent cell을 통한 형질전환효율 측정 그리고 전기영동 실험 방법 1. 실험 과정 200㎖의 LB 배지를 만들기 위해서 먼저 가장 양이 많은 160㎖의 DIW(Deionized Water)를 비커에 채우고 용액을 섞기 위한 magnetic bar도 같이 넣어준다. 그리고 1%의 농도가 되도록 NaCl 2g을 넣고 0.5%의 Yeast extract가 되도록 1g을 넣는다. Tryptone도 1%가 되도록 2g만큼 넣어준 후에, magnetic bar로 섞는다. 이후 200㎖까지 남은 양은 DIW로 채워준다. 이후 멸균을 위해서 15분 동안 121에서 15psi로 autoclave를 시키고 끝나면 4에 둔다. 이후에 있을 실험을 위해서 agar plate가 필요하므로, Ampicillin과 Kanamycin agar plate를 만들어야 한다. 먼저 1000㎖.. Biology/분자생물학 2021. 3. 24. 분자생물학실험 | A. Tumefaciens의 Ti-plasmid를 이용한 담배식물체의 발현위치와 상호작용 실험 방법 1. 실험 과정 분주되어 있는 A. Tumefaciens (strain: GV3101)c-cell을 -70 Deep Freezer에서 꺼내 얼음에 담근다. 5분 정도 녹인 c-cell에 plasmid의 양을 1㎍, 0.1㎍, 0.01㎍로 다르게 넣어주고 c-cell이 깨지지 않게 조심스럽게 tapping하고 액체 질소에 2분 동안 얼리고 5분동안 waterbath에서 녹여준다. 그리고 다시 액체 질소에 동일하게 얼리고 waterbath에서 동일하게 녹여주어 형질전환의 효율을 높인다. 그 다음, 각각의 e-tube에 YEP medium을 1㎖만큼 넣어주고 200rpm으로 28의 shaking incubator에서 1시간동안 둔다. 그리고 5000rpm에서 3분간 원심분리를 하고 cell pell.. Biology/분자생물학 2021. 3. 21. 일반생물학실험 | 항생제의 항균 활성 및 대장균 형질전환 TIP 박테리아의 유전형질을 플라스미드를 이용하여 형질전환시키고 형질전환된 박테리아를 선택하는 과정을 이해한다. 형질전환(Transformation) 외부로부터 주어진 DNA를 받아들여 생물체의 유전적인 성질이 변하는 것을 형질전환(Transformation)이라 한다. 형질전환은 다른 생물 종의 세포에서도 가능하며 플라스미드에 의하지 않고도 가능하다. 형질전환이 모든 세포에서 쉽게 일어나는 것은 아니다. 자연계에서 형질 전환은 박테리아가 유전자 정보를 얻는 주된 과정이 아니다. 이것은 실험실에서 몇 가지 종(Bacillus와 Streptococcus종)만이 쉽게 형질 전환 될 수 있다는 사실에서 알 수 있다. 대장균을 포함한 대부분의 박테리아는 일반적인 조건에서 제한된 양의 DNA만을 도입한다. 이러한.. Biology/일반 | 세포 생물학 2021. 3. 14. 일반생물학실험 | 박테리아의 형질전환(Transformation) TIP 박테리아에 존재하는 플라스미드 DNA에 대해 이해하고, 이를 유전공학적으로 조작한 실험용 플라스미드를 이용해 박테리아의 형질전환을 유도해 봄으로써 유전자 재조합의 기초를 이해한다. 형질전환 형질전환(transformation)은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적 성질을 변하게 하는 일을 말한다. 이는 1928년 영국의 그리피스가 Diplococcus pneumonia를 이용하여 실험한 것이 계기가 되어 발견된 실험 방법이다. 세포는 외부의 DNA를 받아들임으로써 원래 갖고 있는 성질과는 다른 새로운 유전형질을 발현할 수 있게 된다. Transformation 에서는 외부의 DNA를 벡터를 이용해 bacteria cell에 주입해 준다. 이러한 벡터를 이용한 외부 DNA를 세포에 주입.. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 12. 20. 일반생물학실험 | DNA work TIP 세균의 세포벽을 파괴하고 plasmid DNA를 분리한다. 분리한 plasmid DNA를 형질전환을 시키고 배지에서 키운다. 배지에서 키운후 제한효소를 이용해 잘라낸뒤 전기영동을 시켜서 관찰한다. 미생물학 실험을 수행하는 데 있어서 가장 기본이 되는 재료가 DNA이므로 많은 양의 DNA를 확보하는 것이 무엇보다 중요하다. 이를 수행하기 위해 외부 DNA를 숙주 세포 내로 도입시키는 방법인 형질전환(Transformation)을 이용하는데 이 방법은 박테리아 세포에 물리적 내지는 화학적 자극을 주어 Plasmid DNA를 받아들일 수 있는 상태로 만들어, DNA가 세포 내로 들어가게 한 다음, 이들 형질전환 된 세포들을 배양함으로써 이루어진다. 이처럼 DNA를 다량으로 얻는 것 이외에도 Librar.. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 5. 27. 일반생물학실험 | E.coli의 Transformation TIP E.coli의 trasformation 실험을 통해서 유전 공학에 많이 쓰이는 transformation의 기작을 이해하고, 그 방법을 익힌다. Plasmid Plasmid는 원형의 double-stranded DNA로 chromosomal DNA와는 분리되어 있다. 플라스미드는 박테리아나 효모 혹은 기생이나 공생 관계로 보다 고등 eukaryotic cell들 안에 존재한다. 이것은 수천 base pair서부터 100 kilo base pair까지의 다양한 크기를 갖는다. 염색체 DNA와 마찬가지로 이 플라스미드 DNA도 분열전마다 복제된다. 세포 분열 동안 적어도 하나 이상의 플라스미드가 딸세포 속으로 들어가게 되며, 이런 성질로 인해 plasmid는 세대를 계속해서 숙주 세포 안에 존재할 수.. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 5. 1. 분자생물학실험 | 형질전환 유전 물질의 추출 및 확인 - Transformation, Plasmid Preparation, Enzyme Digestion TIP 1. 박테리아의 유전형질을 plasmid를 이용한 유전자도입 방법으로 전환시키고 형질전환된 박테리아를 선택하는 과정 등을 이해한다. 2. 유전물질을 추출해내는 방법에 대하여 알아본다. 3. 유전물질을 확인하고 이에 대해 알아본다. Transformation과 Transfection의 차이점 Transformation은 DNA를 bacterial cell에 넣는 과정으로 이를 통해 host cell의 형질전환을 일으키는 것을 뜻한다. 여기서 bacterial cell이란 E.coli와 같은 원핵세포를 말한다. 주입한 DNA가 들어있는 plasmid를 열이나 전기를 통해 cell안으로 주입시킨다. 반면, Transfection은 DNA를 진핵세포에 직접 넣어주는 것으로 형질 주입이라 한다. 형질전환과.. Biology/분자생물학 2020. 3. 16. 분자생물학실험 | Transformation TIP 1. 실험을 통하여 transformation의 과정을 이해하고, x-gal의 사용하여 transformation의 유무를 판단한다 2. 재조합된 DNA를 competent cell에 삽입하여 형질전환 후, ampicillin과 x-gal이 들어 있는 LB plate에서 배양하여 colony를 형성시킨 후, 색깔로 재조합 DNA를 판별한다. 3. 형질전환 기술을 익힌다. 4. Lac Operon의 Mechanism을 이해한다. 오페론 (0peron) 유전자 발현의 조절 단위 (operation unit). 오페론은 대부분의 경우 원핵생물에만 존재한다. 여러 유전자를 오페론으로 묶어 한꺼번에 발현을 조절하면 유전자들의 발현이 쉽게 조절될 수 있다. 1. 오페론의 구조 : 조절부위 + 구조부위 (전사.. Biology/분자생물학 2020. 3. 8. 분자생물학실험 | 형질전환 - 세균세포에 의한 DNA uptake TIP 외부의 DNA를 세균에 삽입하는 실험을 통해 세균의 형질전환(transformation)에 대해 이해하도록 한다. 대부분의 세균 종들은 그들이 성장하는 배지로부터 DNA분자를 uptake할 수 있다. 이러한 방법으로 uptake된 DNA분자는 분해되지만(restriction and modification에 의해) 종종 생존하여 복제될 수 있다. 특히 이러한 현상은 그 DNA분자가 숙주에 의해 인식될 수 있는 복제 원점(replication origin)을 가지고 있는 플라스미드인 경우 나타난다. 플라스미드의 uptake와 안정적인 보존은 플라스미드가 가지고 있는 유전자의 발현을 관찰함으로써 탐지된다. 항생제에 민감한 세균 세포가 항생제-저항성 유전자를 가진 플라스미드를 uptake하여 이 유전자가.. Biology/분자생물학 2020. 3. 1. 분자생물학실험 | 세균의 형질전환 Transformation의 원리 E.coli는 linear 또는 circular DNA를 받아들일 수 있는데, 이러한 과정을 transformation이라 하며 다음과 같은 단계를 거쳐 이루어진다. E.coli cell이 DNA를 uptake 할 수 있는 상태(competent)로 만들어 주기위해 E.coli cell을 Ca과 같은 multivalent ion의 존재 하에 0℃에서 incubation한다. 이때, cation은 E.coli cell membrane에 존재하는 lipid의 negatively charged phosphate와 complex를 이룰 것으로 추정된다. 낮은 온도는 cell membrane을 응고시켜 charged phosphate의 분포를 안정화하여 cation에 의하여 효과.. Biology/분자생물학 2020. 2. 17. 생화학실험 | 대표적인 생화학 실험 TIP 1. 플라스미드 DNA를 통한 박테리아의 형질전환을 관찰한다. 2. selection marker의 원리를 이해하고, 박테리아를 selection한다. 3. PCR에 필요한 재료와 PCR의 원리를 이해하고, 플라스미드의 일부분을 증폭한다. 4. selection한 박테리아로부터 플라스미드를 추출하여 제한효소와 반응시킨다. 5. 제한효소와 반응시킨 플라스미드와 PCR로 증폭한 DNA를 λ/HindⅢ 마커와 같이 아가로오즈 겔로 전기영동을 하여 나오는 결과를 분석하고 이해한다. pBluescript SK & GDA의 구성 및 특징 Plasmid DNA의 일종인 pBluescript Ⅱ SK(+)는 [그림 1]과 같이 구성이 되어있으며 형질 전환시 암피실린의 내성이 생기는 DNA가 selection m.. Biology/생화학 2020. 2. 17. 분자생물학실험 | 대장균의 형질전환 형질전환 Transformation(형질전환)이란 외부 DNA를 host cell(숙주 세포) 내에 넣어주어 세포가 원래의 성질과는 다른 새로운 유전형질을 추가로 얻게 되는 것이다. 모든 종의 세포에서 자연스럽게 일어나는 것이 아니고, DNA 흡수와 결합에 관련된 세포 표현 단백질인 수용성 요소를 가지고 있는 competent cell에서만 transformation 된다. E. coil의 형질전환은 초기에는 발견이 되지 않았으나 bacteria를 차가운 CaCl2로 처리한 다음 잠시 heat shock 하면 bacteriophage λ가 세포 내로 들어가 phage를 형성한다는 사실에 의해 처음 관찰되었다. 이와 같은 처리는 bacteria의 세포막이 DNA가 infection 될 수 있는 compet.. Biology/분자생물학 2020. 2. 14. 이전 1 2 다음 반응형