반응형 일반생물학실험 | 전기 영동 실험 배경 전기영동의 원리는 단백질 분자들은 표면의 여러 부위에 양전하 또는 음전하를 띄고 있어, 단백질 혼합액 속에 전극을 설치하고 직류전압을 가하면 음극 또는 양극으로 이동하게 된다. 이처럼 전기장 안에서 하전된 입자가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상을 전기영동이라고 한다. 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용익의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류등 여러가지 요인에 따라 결정된다. 이러한 성질에 의해 전기영동법은 아미노산, 뉴클레오티드, 단백질 등과 같은 하전된 물질들을 분리하거나 분석하는데 매우 효과적인 방법으로 이용된다. 전기영동법은 여러 종류가 있는데, 첫 번째로는 이동계면 전기영동법이다. 두 번째는 띠 전기영동법이다. 이 방법은 적.. Biology/일반 | 세포 생물학 2024. 1. 22. 생화학실험 | 형질 전환 실험 개요 형질전환이란 외부에서 만들어진 plasmid를 plasmid가 없는 원핵 세포 cell에 넣어 그 원핵 세포가 본래 성질과는 다른 새로운 유전형질을 나타내게 하여 삽입한 plasmid를 대량으로 키우는 과정이다. 형질전환은 폐렴구균을 통해 DNA가 유전물질임을 PCR과 클로닝 등의 방법으로 증명했다. 인슐린의 경우 처음에는 돼지에게서 추출했지만 많은 수요에 비해 공급은 원활하지 못 했고 깨끗하지 않을 수도 있다는 의견 때문에 중지되었다. 그 후, 인간에게서 인슐린을 만드는 단백질(염기서열)을 찾아내어 인슐린을 공급할 방법을 개발해내었다. 형질전환에서 가장 필요한 것은 제한효소이다. 제한효소는 하등한 원핵세포들이 면역 작용을 하기 위해 가지고 있는 효소로 한 제한효소는 한 특정 염기서열을 잘라내.. Biology/생화학 2023. 10. 25. 일반생물학실험 | 전기영동을 이용한 플라스미드의 결정 TIP 전기영동을 이용하여 각 시료를 분석하고 제한 효소로 처리된 플라스미드 벡터의 크기를 이용하여 플라스미드의 종류를 알아내는 것이다. 서론 전기영동은 주로 생체 고분자들의 성질을 연구하고, 그것들을 분석, 분리, 정제하는 중요한 방법 중의 하나이다. 전기영동은 DNA, RNA나 단백질 같은 것들이 고유의 전하를 띠고 있고, 그것들이 어떤 전기장에 놓이게 되면 이동할 수 있다는 사실을 기본으로 하고 있다. 이러한 물질들의 이동 정도는 각 물질의 크기나 모양 그리고 전하에 따라 달라진다. 즉, 크기가 큰 물질은 크기가 작은 물질보다 더 천천히 겔을 통과하기 때문에 크기에 따라 물질들이 분리된다. 본 실험에서 사용한 아가로오스는 해상도는 낮지만 아주 넓은 범위(200bp-50kb)의 DNA나 RNA 시료를.. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 12. 25. 세포생물학실험 | Extraction of genomic DNA Plasmid의 특징 Plasmid는 박테리아 세포 내에 독립적으로 존재하는 환형의 DNA 분자이다. 이들은 대부분 하나 이상의 유전자를 가지고 있으며, 이들 유전자는 종종 숙주세균에 의해 보여지는 유용한 특징을 담당하고 있다. 예를들어 항생제의 정상적인 독성농도에서 생존하는 능력은 항생제 저항성 유전자를 가진 plasmid가 세균 내에 존재하기 때문이다. 실험실에서 이러한 항생제 저항성은 종종 선별표지(Selection marker)로 이용된다. 모든 plasmid는 복제 개시점(origin of replication)이 될 수 있는 최소한 한 개의 DNA 염기서열을 갖고 있어서 세포 내에서 세균의 염색체와는 독립적으로 복제할 수 있다. 어떤 plasmid는 세균의 염색체 속으로 자신을 삽입시켜 복제한.. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 12. 10. 보건환경미생물학실험 | Heterologous expression of the transformed gene TIP 형질전환된 미생물에서 plasmid에 의해 이형발현시켜, 생성된 단백질로 형질전환이 잘 되었는지 확인하고, 어떤 과정에서 잘못되었는지 점검하고자 한다. IPTG induction isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside의 약칭으로, lac operon 효소합성을 유도하는 강력한 유발물질이다. 비분해 비대사성이 유도물질이라 미생물이 합성을 계속 유도시킨다. lacZ gene에서 β-galactosidase 만들 때 필요하다. allolactose와 유사한 젖당유사체로서, inhibitor(repressor)와 결합하여, E. coli의 RNApolymerase가 lac promoter를 인식하도록 하여, T7 polymerase gene을 전사하도록 하는 역할을 담당한다.. Engineering/환경 | 토양 | 폐기물처리 공학 2022. 10. 10. 일반생물학실험 | 플라스미드의 분리 TIP 세균 DNA를 구성하고 있는 염색체와 플라스미드의 차이를 알고, 이론을 바탕으로 한 플라스미드 DNA를 분리한다. 플라스미드 세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 환형 DNA분자로서, 고리 모양을 띠고 있으며 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니다. 다른 세균세포에서도, 발현이 가능하기 때문에 유전공학에서는 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소로 끊은 뒤, 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자재조합 기술을 사용한다. 실험 방법 1. 실험 과정 1) 8.000rpm에서 3분 동안 원심분리를 통해 세포를 채취한다. 2) 박테리아 세포 알갱이들을 Buffer P1 250㎕으로 재부유 시킨다. 3) Buffer P2 250㎕.. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 10. 4. 일반생물학실험 | Plasmid 분리 실험 & Agarose gel을 이용한 plasmid 전기영동 TIP E.coli를 배양해 플라스미드를 분리하고, 분리한 플라스미드를 직접 만든 Agarose gel을 이용하여 전기 영동한다. 전기영동의 원리 DNA 젤 전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라 분리하는 간단한 방법이다. 50V-100V 정도의 전류를 장치에 흘려보낸다. DNA는 기본골격에 있는 인산기 때문에 전기영동에 사용되는 완충용액 속에서 (-)전하를 띠고 있으며 따라서 두 전극 사이에 위치해 있을 때 (+)극 쪽으로 움직이게 된다. 이 때 DNA 분자가 젤 매트릭스를 통과하는 속도는 분자량이 커질수록 늦어지며 젤의 밀도가 클수록 늦어진다. 또한 DNA의 분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다르다. 예를 들면 supercoil된 DNA는 선형 DNA보다 빠르게 움직이는 것으로 알려져 있.. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 10. 1. 일반생물학실험 | 원형 DNA인 plasmid DNA Plasmid 세포 내에서 핵이나 염색체와 독립적으로 존재하면서 자율적으로 자가증식해 자손에 전해지는 유전요인이다. 1952년에 미국의 유전학자 J.레더버그가 세균류의 염색체 이외의 유전요인을 플라스미드라고 명명했는데, 최근에는 진핵생물도 포함해 세포질 인자와 같은 뜻으로 흔히 쓰인다. plasmid의 특징은 다음과 같다. 1) 원형의 이중가닥 DNA(circular double-standed DNA)이다 2) 세포내에서 염색체 DNA와는 별개로 존재 3) 자기 스스로 복제가 가능 4) 대부분 세균에 존재하나, 일부 진핵세포에도 존재 5) 복제기점(DNA 복제의 시작점으로 숙주 범위 및 plasmid DNA의 copy를 결정)이 존재한다 6) 항생제 저항성 유전자(R인자)를 가진다. 7) 다중 제한효소 .. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 9. 30. 일반생물학실험 | 플라스미드 추출 플라스미드는 생장에 필수적인 염색체이며 DNA에서 물리적으로 분리 돼 있는 대표적인 에피솜 DNA분자라고 한다 1953년에 미국의 유전학자 레더버그가 처음으로 플라스미드를 세균의 염색체 말고 독자적으로 증식을 할 수 있는 DNA 분자라는 의미로 이름을 지었다고 한다. 쉽게 말하면 플라스미드는 세균에서 발견이 되는 염색에 이외에 DNA이고 고리모양의 이중가닥 DNA 모양으로 수천개에서 수만개의 염기쌍으로 이루어져 있다고 한다. 하나의 세포내에 여러 개 존재하고 염색체와는 독립적으로 복제가 된다는 게 특징이다. 또 생존에 필수적이지는 않지만 특정한 환경에서 생존을 하는데 유리한 유전자들이 존재한다. 또 세균에 존재하지만 효묘와 같은 진핵 생물에서도 발견이 된다고 한다. 플라스미드의 형태로는 원형 DNA의 한.. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 9. 28. 일반생물학실험 | 플라스미드 추출 TIP Mini-prep라 불리는 Alkaline lysis method을 이용하여 Plasmid DNA을 추출한다. Alkaline lysis Alkaline lysis의 기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrance을 부수고 DNA만을 분리하는 것이다. 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리해야 한다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다. 실험 방법 1. Spin Down Bacterial cells 1) Harvesting ① 1.5㎖의 b.. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 9. 27. 일반생물학실험 | 플라스미드 DNA 추출 TIP Alkaline lysis (denaturation) method에 대해 알아보고 이 방법을 통해 플라스미드 DNA를 추출해본다. DNA Mini prep이란 말을 쓰는데 prep은 ‘prepartion’의 줄임말로 DNA를 소량으로 추출한다는 의미이다. plasmid를 추출하는 방법으로는 기본적으로 여러가지가 있지만 그 가운데 대표적인 방법으로 alkaline lysis (denaturation) method가 이용되고 있다. 세포내에 DNA는 일반적인 double-helix를 형태를 가지는 반면 plasmid는 동그란 모양인 supercoiled형태를 가짐으로써 pH의 변화에 따라서도 plasmid의 형태 와 구조가 크게 변하지 않는다는 특징을 가지고 있다. plasmid는 주로 vector로.. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 9. 26. 생명공학실험 | Plasmid DNA preparation TIP Ampicillin에 대하여 저항성을 지닌 E. coli (XLI-Blue, Amp-r) 의 plasmid DNA pBluescript SKⅡ(+)를 isolation 한다. Plasmid DNA를 정제하기 위해서 여러 가지 방법들이 사용되는데 공통적으로 다음의 세 과정- 미생물의 배양과 플라스미드 증폭 ; 미생물 수거와 cell lysis ; plasmid DNA 정제-을 거친다. DNA를 분리하기 위해서는 일단 DNA가 세포 밖으로 유출되도록 세포벽 및 세포막을 분해 시켜야 하고, 이때 DNA 가수분해 효소들의 활성을 억제하는 조건에서 DNA를 분리해야 하며 단백질이나 RNA가 같이 회수되지 않도록 해야 한다. 세포벽을 가지는 박테리아의 경우에는 먼저 lysozyme을 처리하여 세포벽을 분해 .. Biology/생명 과학 | 공학 2022. 9. 24. 일반생물학실험 | 플라스미드 DNA 추출 TIP Recombinant DNA plasmid가 들어있는 E.coli로부터 plasmid를 직접 추출하여 분자생물학적 실험의 기본이 되는 DNA관련 실험에 대해 이해한다. 외부 DNA를 E.coli에 도입시켜 형질전환이 이루어지게 하면 이 세포들은 기존에 갖고 있던 chromosomal DNA 뿐만 아니라 plasmid DNA도 갖고 있게 된다. 특정한 DNA를 확보하고 싶을 때, 그 plasmid DNA를 숙주세포에 도입한 후, 따로 분리해내면 원하는 것을 얻을 수 있다. 이 실험에서 Ampicillin이 포함된 LB배지에서 키운 형질전환된 Ampicillin 저항성 E.coli를 이용하여 특정한 plasmid DNA를 얻는다. 실험 방법 1. 실험 과정 1) Ampicillin이 포함된 LB배지에.. Biology/일반 | 세포 생물학 2022. 9. 24. 일반생물학실험 | DNA 추출과 전기영동 TIP DNA 추출법을 알고, 전기영동의 원리를 이해한다. DNA 추출 1. Plasmid 세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA로, 고리 모양을 띠고 있으며 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니다. 유전공학에서는 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소로 끊은 뒤, 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자재조합 기술을 사용한다. 2. Plasmisd의 특징 ① 복제기점(original of replication)을 갖기 때문에 증식할 수 있다. ② 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene)을 가져 selection marker로 사용될 수 있다. ③ Multi cloning site(MCS)가 존재.. Biology/일반 | 세포 생물학 2021. 5. 1. 분자생물학실험 | E-coli Plasmid DNA 정제 플라스미드(plasmid) 플라스미드는 외부염색체 DNA분자를 작은 염색체로 전이 이동시키는 것이다. 정의에 따라 플라스미드는 복제단위(replicon)로써 외부염색체 상태에서 안정적으로 유전되는(특별한 분리 없이 유지되는)물질 이다. 전부는 아니지만 대개의 플라스미드는 세포의 생존에 꼭 필수적인 것은 아니다. 그러나 항생제가 존재하는 여러 경우에서는 생존에 필수적인 존재가 되기도 한다. 플라스미드의 기본적 특징은 다음과 같다. 1) 세포내에서 염색체와는 독립적으로 존재하는 환상의 DNA이다. 2) 세균의 항생제에 대한 저항성은 세균이 갖고 있는 플라스미드에 기인된다. (선발표지로 이용된다.) 3) 모든 플라스미드는 복제 개시점(origin of replication)이 될 수있는 적어도 한 개의 DNA.. Biology/분자생물학 2021. 3. 14. 일반생물학실험 | 대장균 DNA의 추출과 정량 본 실험은 대장균(Escherichia coli)의 DNA(deoxyribonucleic acid)를 추출하고, 겔 전 기영동법(gel electrophoresis)으로 DNA의 추출 여부를 알아보고자 하는 실험이었다. 먼저 Escherichia coli 배양액에서 Escherichia coli를 원심분리하여 얻었다. supernatant를 제거 한 후, Escherichia coli를 EDTA, SDS, NaOH 용액 등으로 세포벽과 단백질 등을 파괴한 다. 그 후 NaCl과 etahnol을 넣어 DNA를 농축시켜 얻는다. 이렇게 얻은 DNA를 RT에서 hydration 시킨 후 gel electrophoresis를 이용해 DNA의 상대적 질량, 양 등을 알아보았다. 그리고 gel electrophor.. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 12. 30. 일반생물학실험 | E.coli의 Transformation TIP E.coli의 trasformation 실험을 통해서 유전 공학에 많이 쓰이는 transformation의 기작을 이해하고, 그 방법을 익힌다. Plasmid Plasmid는 원형의 double-stranded DNA로 chromosomal DNA와는 분리되어 있다. 플라스미드는 박테리아나 효모 혹은 기생이나 공생 관계로 보다 고등 eukaryotic cell들 안에 존재한다. 이것은 수천 base pair서부터 100 kilo base pair까지의 다양한 크기를 갖는다. 염색체 DNA와 마찬가지로 이 플라스미드 DNA도 분열전마다 복제된다. 세포 분열 동안 적어도 하나 이상의 플라스미드가 딸세포 속으로 들어가게 되며, 이런 성질로 인해 plasmid는 세대를 계속해서 숙주 세포 안에 존재할 수.. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 5. 1. 분자생물학실험 | 형질전환 유전 물질의 추출 및 확인 - Transformation, Plasmid Preparation, Enzyme Digestion TIP 1. 박테리아의 유전형질을 plasmid를 이용한 유전자도입 방법으로 전환시키고 형질전환된 박테리아를 선택하는 과정 등을 이해한다. 2. 유전물질을 추출해내는 방법에 대하여 알아본다. 3. 유전물질을 확인하고 이에 대해 알아본다. Transformation과 Transfection의 차이점 Transformation은 DNA를 bacterial cell에 넣는 과정으로 이를 통해 host cell의 형질전환을 일으키는 것을 뜻한다. 여기서 bacterial cell이란 E.coli와 같은 원핵세포를 말한다. 주입한 DNA가 들어있는 plasmid를 열이나 전기를 통해 cell안으로 주입시킨다. 반면, Transfection은 DNA를 진핵세포에 직접 넣어주는 것으로 형질 주입이라 한다. 형질전환과.. Biology/분자생물학 2020. 3. 16. 이전 1 2 다음 반응형
