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  분자생물학실험 | E.coli 에서의 GFP발현 유도 TIP 원하는 유전자(GFP)를 plasmid를 이용하여 bacteria에서 발현시켜 볼 수 있다. GFP(Green Fluorescent Protein) Bioluminescent jellyfish (해파리) Aequorea victoria는 특징적인 초록 형광을 낸다. 이것은 칼슘-결합 광단백질 (calcium-binding photoprotein)과 green fluorescent protein (GFP)의 두 단백질에 의한 것이다. 최근 10년 동안 GFP는 생화학과 분자 생물학 분야에서 가장 흥미로운 단백질의 하나로 여겨져 왔다. GFP는 발광하는 특성 때문에 정량적인 측정이 쉬워서 박테리아에서 형체 전이 마우스에 이르기까지 광범위한 생명체내에서 우리가 연구하고자 하는 유전자가 언제 어디서 얼마.. Biology/분자생물학 2020. 3. 21.

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  분자생물학실험 | 형질전환 유전 물질의 추출 및 확인 - Transformation, Plasmid Preparation, Enzyme Digestion TIP 1. 박테리아의 유전형질을 plasmid를 이용한 유전자도입 방법으로 전환시키고 형질전환된 박테리아를 선택하는 과정 등을 이해한다. 2. 유전물질을 추출해내는 방법에 대하여 알아본다. 3. 유전물질을 확인하고 이에 대해 알아본다. Transformation과 Transfection의 차이점 Transformation은 DNA를 bacterial cell에 넣는 과정으로 이를 통해 host cell의 형질전환을 일으키는 것을 뜻한다. 여기서 bacterial cell이란 E.coli와 같은 원핵세포를 말한다. 주입한 DNA가 들어있는 plasmid를 열이나 전기를 통해 cell안으로 주입시킨다. 반면, Transfection은 DNA를 진핵세포에 직접 넣어주는 것으로 형질 주입이라 한다. 형질전환과.. Biology/분자생물학 2020. 3. 16.

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  분자생물학실험 | Transformation TIP 1. 실험을 통하여 transformation의 과정을 이해하고, x-gal의 사용하여 transformation의 유무를 판단한다 2. 재조합된 DNA를 competent cell에 삽입하여 형질전환 후, ampicillin과 x-gal이 들어 있는 LB plate에서 배양하여 colony를 형성시킨 후, 색깔로 재조합 DNA를 판별한다. 3. 형질전환 기술을 익힌다. 4. Lac Operon의 Mechanism을 이해한다. 오페론 (0peron) 유전자 발현의 조절 단위 (operation unit). 오페론은 대부분의 경우 원핵생물에만 존재한다. 여러 유전자를 오페론으로 묶어 한꺼번에 발현을 조절하면 유전자들의 발현이 쉽게 조절될 수 있다. 1. 오페론의 구조 : 조절부위 + 구조부위 (전사.. Biology/분자생물학 2020. 3. 8.

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  분자생물학실험 | 형질전환 - 세균세포에 의한 DNA uptake TIP 외부의 DNA를 세균에 삽입하는 실험을 통해 세균의 형질전환(transformation)에 대해 이해하도록 한다. 대부분의 세균 종들은 그들이 성장하는 배지로부터 DNA분자를 uptake할 수 있다. 이러한 방법으로 uptake된 DNA분자는 분해되지만(restriction and modification에 의해) 종종 생존하여 복제될 수 있다. 특히 이러한 현상은 그 DNA분자가 숙주에 의해 인식될 수 있는 복제 원점(replication origin)을 가지고 있는 플라스미드인 경우 나타난다. 플라스미드의 uptake와 안정적인 보존은 플라스미드가 가지고 있는 유전자의 발현을 관찰함으로써 탐지된다. 항생제에 민감한 세균 세포가 항생제-저항성 유전자를 가진 플라스미드를 uptake하여 이 유전자가.. Biology/분자생물학 2020. 3. 1.

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  분자생물학실험 | 세균의 형질전환 Transformation의 원리 E.coli는 linear 또는 circular DNA를 받아들일 수 있는데, 이러한 과정을 transformation이라 하며 다음과 같은 단계를 거쳐 이루어진다. E.coli cell이 DNA를 uptake 할 수 있는 상태(competent)로 만들어 주기위해 E.coli cell을 Ca과 같은 multivalent ion의 존재 하에 0℃에서 incubation한다. 이때, cation은 E.coli cell membrane에 존재하는 lipid의 negatively charged phosphate와 complex를 이룰 것으로 추정된다. 낮은 온도는 cell membrane을 응고시켜 charged phosphate의 분포를 안정화하여 cation에 의하여 효과.. Biology/분자생물학 2020. 2. 17.

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  분자생물학실험 | 대장균의 형질전환 형질전환 Transformation(형질전환)이란 외부 DNA를 host cell(숙주 세포) 내에 넣어주어 세포가 원래의 성질과는 다른 새로운 유전형질을 추가로 얻게 되는 것이다. 모든 종의 세포에서 자연스럽게 일어나는 것이 아니고, DNA 흡수와 결합에 관련된 세포 표현 단백질인 수용성 요소를 가지고 있는 competent cell에서만 transformation 된다. E. coil의 형질전환은 초기에는 발견이 되지 않았으나 bacteria를 차가운 CaCl2로 처리한 다음 잠시 heat shock 하면 bacteriophage λ가 세포 내로 들어가 phage를 형성한다는 사실에 의해 처음 관찰되었다. 이와 같은 처리는 bacteria의 세포막이 DNA가 infection 될 수 있는 compet.. Biology/분자생물학 2020. 2. 14.

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  분자생물학실험 | RNA Isolation and analysis TIP 세포에서 RNA를 추출하기 위해서 RNA를 RT–PCR 하여 cDNA 상태로 만들고 cDNA를 PCR 하여 sample을 loading 하고 band를 확인하기 위함이다. RNA 추출 원리 포유세포는 보통 한 세포 당 10-5㎖ RNA를 포함하고 있으며 이 중 80∼85%가 rRNA, 15∼20% 가 tRNA, 1∼5%가 mRNA로 이루어져 있다. 리보솜 RNA나 tRNA 등은 일정한 크기와 염기서열을 가 지고 있기 때문에 전기영동, 초 원심 분리 및 크로마토그래피에 의해 순수하게 분리할 수 있는 반면, mRNA는 크기도 다양하고 많은 종류가 혼합되어 있기 때문에 한 종류의 mRNA를 순수 분리하기가 쉽지 않다. 그러나 진핵세포 mRNA는 3말단에 poly(A)를 가지고 있기 때문에 리보솜 RNA.. Biology/분자생물학 2020. 2. 10.

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  분자생물학실험 | Gene Cloning TIP Gene cloning으로 DNA를 자르고 붙이고 변형시켜서 실험에 필요한 재조합 DNA를 제조하고, 기본적인 효소의 처리와 DNA의 분리 및 조작방법 이용하여 분자생물학의 기본을 배우기 위함이다. Gene cloning 동식물의 한 개체에서 수정을 거치지 않고, 무성생식에 의하여 양친과 똑같은 유전자 조성을 가진 개체를 얻는 기술이다. 그 개체군을 클론이라고 하며, 꺾꽃이, 접붙이기, 포기나누기 등으로 증식시킨 개체도 클론이라고 일컫는다. 클로닝은 암수의 유전자가 서로 섞이지 않으므로 우수한 품종을 보존하기 위한 가장 좋은 방법이다. 당근, 담배 등과 같은 식물에서는 성공사례가 많으며, 육종에 효과적으로 이용하고 있다. 동물의 경우도 양서류에서 성공하고 있다. 1963년 J.B 가든은 아프리카 .. Biology/분자생물학 2020. 2. 6.

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  분자생물학실험 | Western blotting TIP 1. PTM(post-translational modifications)의 의미와 N-linked 와 O-linked glycosylation의 차이를 알 수 있다. 2. 균주 Hansenula polymorpha를 YPM배지에서 배양한 후, TCA down을 통해 세포외 단백질을 농축하여 얻고 cell lysis를 통해 세포내 GOD 단백질을 얻고 OD값 측정으로 단백질 정량을 할 수 있다. 3. SDS-PAGE의 방법과 원리를 이해하고 만들어 Western blotting을 통해 GOD 단백질의 발현 여부와 그 크기를 알 수 있다. SDS-Page Acrylamide를 가교제 (cross-linker)로 중합한 polyacrylamide gel은 acrylamide와 가교제의 농도 및 비율에 .. Biology/분자생물학 2020. 1. 31.

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  분자생물학실험 | 제한효소 처리 및 Agarose gel에서 DNA 회수 TIP 본 실험에서는 플라스미드 DNA를 이용한 제한효소처리를 통하여, 이론적으로만 배웠던 제한효소의 반응원리를 실제로 수행하였다. 이를 통해 서로 다른 제한효소의 특성을 이해하고, 제한효소 반응 시 고려해야 할 점을 알아보았다. 그리고 Agarose gel 전기영동 결과를 관찰해 봄으로서 절단된 DNA 조각들의 크기를 알아보고 제한효소 처리가 잘 되었는지 확인해보았다. 또한 DNA 분자에서 여러 제한효소의 인식염기서열의 상대적인 위치를 알 수 있으므로 제한효소 지도를 작성해 보고자 한다. 유전자 클로닝이나 재조합, DNA의 생화학적 연구, 유전자의 구조 연구나 유전자의 발현 조절 연구의 기본이 되는 유전자 조작 기술에는 DNA의 절단과 연결, DNA 증폭이나 RNA 합성 또는 특별한 작용기의 첨가와 제.. Biology/분자생물학 2020. 1. 27.

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  식물분자생물학 연습 | Polymerase chain reaction Agarose Gel Analysis Polymerase chain reaction 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있습니다. 즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있습니다. 중합효소 연쇄반응을 통하여 in vitro 상에서 특정 부위의 DNA를 ∼ 배까지 수 시간내에 증폭시킬 수.. Biology/분자생물학 2020. 1. 21.

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  분자생물학실험 | RNA 추출과 RT-PCR RNA 추출 원리 포유세포는 보통 한 세포 당 10-5㎖ RNA를 포함하고 있으며 이 중 80∼85%가 rRNA, 15∼20% 가 tRNA, 1∼5%가 mRNA로 이루어져 있다. 리보솜 RNA나 tRNA 등은 일정한 크기와 염기서열을 가 지고 있기 때문에 전기영동, 초 원심 분리 및 크로마토그래피에 의해 순수하게 분리할 수 있는 반면, mRNA는 크기도 다양하고 많은 종류가 혼합되어 있기 때문에 한 종류의 mRNA를 순수 분리 하기가 쉽지 않다. 그러나 진핵세포 mRNA는 3말단에 poly(A)를 가지고 있기 때문에 리보솜 RNA나 tRNA 등으로부터 분리해 낼 수 있다. RNA를 추출할 때 가장 주의해야 할 점은 핵산 가수분해효소에 의해 분해되지 않고 완전하게 얻는 것이며, 또한 단백질이 제거된 순수한.. Biology/분자생물학 2020. 1. 18.

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  분자생물학실험 | Midi-preparation of plasmid DNA Midi-preparation mini-preparation 과 실험의 원리가 똑같으나, 실험자가 원하는 gene의 수를 늘리기 위해, 즉 bacteria를 증폭시키기 위해 scale을 늘린 실험. mini-preparation은 5∼10㎍을 준비하는데 비해, midi-preparation은 ∼100㎍정도의 양까지 증폭시킨다. 실험 방법 Step 1 : 선처리 1) inoculate two single well isolated colonies into two 1.5 ㎖ LB+amp (working concentration 50 ㎎/㎖) culture tubes (a colony/clone per tube) 2) incubate for approximately 8 hours at 37℃ with vigor.. Biology/분자생물학 2020. 1. 12.

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  분자생물학실험 | Real–Time PCR TIP real-time PCR의 기본원리를 이해하고, 직접 real-time PCR을 수행하여, DNA를 많은 양으로 증폭시킨다. DNA polymerase (DNA 중합 효소) PCR의 반응은 DNA 중합효소에 연관되어 있으며 좋은 효소를 선택하는 것이 좋은 결과를 얻기 위해서 중요하다. 낮은 온도에서 나타나는 Taq DNA 중합효소의 활성이 PCR 반응의 특이성에 영향을 미치는 원인 중 하나다. 이러한 경우 primer는 DNA에 비특이적으로 결합하게 되며 비특이적인 산물을 만들어내게 된다. 이러한 문제를 최소화하기 위해서 “hot-start” 기능을 가진 효소를 사용해야 하는데 이 효소는 낮은 온도에서나 초기 DNA denature 과정에서의 Taq의 활성을 억제하게 되어 이러한 비특이적인 산물을.. Biology/분자생물학 2020. 1. 6.

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  분자생물학실험 | Polymerase chain reaction(PCR)에 의한 DNA절편의 증폭 TIP PCR의 원리를 이해하고 실제로 DNA의 절편을 증폭하여 본다. PCR과 체내 DNA 합성 1. DNA 두 가닥을 푸는 방법 ① PCR : 온도를 높여 주어서 DNA 이중나선을 푼다. ② 체내 DNA 합성 : 헬리카아제(DNA helicase)라는 효소를 이용하여 DNA 이중나선을 풀고, 단일 가닥 DNA 결합단백질(single strand DNA binding protein)이 분리된 DNA 사슬이 다시 되붙지 못하도록 막는다. 2. 사용하는 polymerase ① PCR : DNA 이중나선이 풀어서 합성해야 하므로, 내열성 DNA polymerase인 Taq polymerase를 사용한다. ② 체내 DNA 합성 : 체내에서는 많은 효소를 사용하기 때문에 내열성 DNA polymerase를 필요.. Biology/분자생물학 2020. 1. 2.

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  분자생물학개론 | Flow cytometer(FACS)의 원리 및 응용 TIP 1. Flow Cytometry 의 발전 역사 2. Flow Cytometry 3. Flow Cytometry 의 원리 4. Flow Cytometry 의 응용 Flow Cytometry의 발전 역사 1930년 스웨덴 Karolinska Institute의 Caspersson이 세포내 핵산과 단백질 양을 측정하기 위해 microspectrophotometer를 개발한 것이 가장 시초이다. 1947년 Northwestern대학(미국)의 Gucker등에 의해 공기를 빠른 속도로 주입하면서 검체를 실려 보내고 입자가 통과하면 빛이 산란되어 photodetector에서 전기 신호를 검출해낼 수 있는 최초의 Flow cytometer가 개발 되었다. 1950년 형광 항체가 개발되었으며 이즈음 hematol.. Biology/분자생물학 2019. 12. 27.

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  분자생물학개론 | 이중 특이성 항체의 제조 방법 TIP 1. 생체내 접근법 2. 시험관내 접근법 3. 배합 접근법 생체내 접근법 적합한 동물을 항원으로 면혁화시켜 생체내 항체 레퍼토리를 항원에 노출시킨 후, 동물로부터 관심대상의 항체 또는 항체들을 회수하는 것이다. 이 방법은 이중 특이성 항원을 사용한 이중 특이성 항체의 제조 및 관심대상의 두 개의 구조적으로 관련된 분자를 특이적으로 인식하는 항체의 선택에 적용시킬 수 있다. 적합한 환자(포유동물, 상기 포유동물의 유전자이식 된 형태, 녹아웃 형태를 포함)를 이중 특이성 항원의 면역원성 제제로 면역화시킴으로써 제조할 수 있다. 적합한 면역원성 제제는 (예를 들면) 화학적 합성, 재조합적으로 발현된 이중 특이성 항원을 함유할 수 있다. 프로인트 완전 또는 불완전 보조제, 또는 유사한 면역자극성 화합물 .. Biology/분자생물학 2019. 12. 23.

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  분자생물학개론 | EGF - 상피세포 성장인자 TIP 1. EGF (Epidermal growth factor)의 정의 2. EGF의 효과 3. EGF 의 활성 4. EGF 와 유사한 물질 EGF (Epidermal growth factor) EGF는 'Epidermal Growth Factor'의 약자로 ‘상피세포 성장인자’라고 불린다. 인체의 자연적인 상처치유 과정에서 새살(육아조직)을 돋게 하고 혈관을 재생시키는 몸 안의 상처치유 물질이다. 주로 사람의 체액에 고루 분포되어 있고 53개의 아미노산으로 이루어져 있다. 미국의 생물학자 스탠리· 코헨(Stanley Cohen) 박사에 의해 발견되었다. 코헨 박사는 동물이 상처를 혀로 핥아주기만 하면 아무는 것에 착안하여 생쥐 침샘 연구를 시작했다. 생쥐의 턱밑 샘 추출물을 갓 태어난 생쥐에게 주사하.. Biology/분자생물학 2019. 12. 19.