반응형 분자생물학실험 | Competent cell을 통한 형질전환효율 측정 그리고 전기영동 실험 방법 1. 실험 과정 200㎖의 LB 배지를 만들기 위해서 먼저 가장 양이 많은 160㎖의 DIW(Deionized Water)를 비커에 채우고 용액을 섞기 위한 magnetic bar도 같이 넣어준다. 그리고 1%의 농도가 되도록 NaCl 2g을 넣고 0.5%의 Yeast extract가 되도록 1g을 넣는다. Tryptone도 1%가 되도록 2g만큼 넣어준 후에, magnetic bar로 섞는다. 이후 200㎖까지 남은 양은 DIW로 채워준다. 이후 멸균을 위해서 15분 동안 121에서 15psi로 autoclave를 시키고 끝나면 4에 둔다. 이후에 있을 실험을 위해서 agar plate가 필요하므로, Ampicillin과 Kanamycin agar plate를 만들어야 한다. 먼저 1000㎖.. Biology/분자생물학 2021. 3. 24. 일반생물학실험 | 제한효소를 통한 DNA 분해와 전기 영동 TIP 추출해낸 DNA를 제한 효소를 사용하여 여러 개의 DNA 조각으로 분리한 후, 전기영동을 통하여 원하는 DNA 분자가 유입되었는지를 확인한다. 본 실험에는 DNA를 제한 효소로 절단하는 과정이 포함되어 있다. 제한 효소는 원래 세균이 침투한 외래 DNA를 변형 및 파괴시키기 위하여 존재하는 효소이다. 그러나 이 제한 효소는 그 세균의 DNA도 절단할 수도 있기 때문에 그것을 방지하기 위해 세균은 자신의 DNA에 메틸화(methylation)을 하는 등의 방법을 통해 자신의 DNA를 보호한다. 제한 효소는 이중 나선 구조로 된 DNA의 회문식 염기서열, 즉 앞으로 읽으나 뒤로 읽으나 염기서열이 같은 모양을 하고 있는 특징적인 염기서열을 인식하여 절단한다. 잘린 후의 DNA 말단의 모양은 두 종류가 .. Biology/일반 | 세포 생물학 2021. 2. 1. 일반생물학실험 | 제한효소반응과 전기영동 본 실험의 주제는 제한효소반응과 전기영동이다. 유전자 클로닝과 유전공학은 특정 염기서열을 인지하고 절단하는 제한효소(restriction enzyme)의 발견에 의해서 가능하게 되었다. 자연에서 이러한 효소들은 파지 혹은 다른 생명체의 DNA가 박테리아 세포 내로 들어오는 것을 막아준다. 그들은 제한(restriction)이라고 불리는 과정으로 외부 DNA를 절단하는 역할을 한다. 각각의 제한효소는 제한효소자리(restriction site, 일반적으로 4~8개 염기서열)라는 특정 염기서열을 인지하고 DNA 두 가닥을 자른다. 박테리아는 제한효소자리에 있는 아데닌이나 시토신에 메틸기(-CH3)를 첨가함으로써 제한효소로부터 자신의 DNA를 보호한다. 제한효소는 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을.. Biology/일반 | 세포 생물학 2021. 1. 31. 생명과학실험 | Protein Purification과 Electrophoresis(SDS-PAGE) TIP 추출해낸 Protein을 Purification하여 원하는 단백질만을 얻어내는 방법을 알아보고, SDS-PAGE Gel을 이용해 Electrophoresis하여 직접 눈으로 확인한다. 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography) 1) 친화성 크로마토그래피는 단백질과 지지체 위에 결합되어 있는 ligand 사이의 특이한 화학적 상호작용에 기초로 하는 분리 방법 예) 효소-억제제, 항원-항체 반응 2) Ligand 와 단백질 사이의 친화성 결합은 분자의 크기와 모양에 특이적인 결합 (Specific binding) 3) Column 내 정지상에 단백질과 상호작용하는 ligand 를 결합시킨 지지체 사용 4) 친화성 크로마토그래피에서 ligand 를 붙일 때 고체 matrix 에.. Biology/생명 과학 | 공학 2020. 9. 14. 생명과학실험 | DNA cloning와 전기영동 플라스미드(Plasmid)는 환상 DNA 분자들이며 독자적으로 염색체를 복제할 수 있고, 또 크기는 세균성 염색체 크기의 0.05-10%에 해당한다. 세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA로, 고리 모양을 띠고 있으며 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니며 또 플라스미드는 다른 종의 세포 내에도 전달된다. 이러한 특성을 이용하여 플라스미드는 유전공학에 폭넓게 이용되고 있다. cDNA는 Complimentary DNA, 즉 상보적 DNA란 뜻이며, mRNA를 주형으로 하여 상보적인 DNA (cDNA)를 합성하는 효소인 Reverse Transcriptase를 mRNA에 A, T, C, G와 함께 첨가하여 적정 환경에 놓아두면 cDNA가 합성된다. 우선 mRNA를 r.. Biology/생명 과학 | 공학 2020. 9. 13. 일반생물학실험 | 제한효소에 의한 plasmid DNA 절단 - 전기영동 TIP 전기영동의 원리를 이해하고, 직접 시험관 내 plasmid DNA를 전기영동하여 본다. 제한효소를 이용한 DNA의 절단 및 붙이기 제한효소 1 unit는 1 ㎍의 DNA를 최적 온도에서 한 시간에 절단할 수 있는 양이다. 상품화된 효 소는 효소마다 다르지만 대개 10 units/㎕ 내외의 농도로 공급된다. 제한효소 처리 반응은 절단하 려고 하는 DNA, 반응완충용액, 제한효소로 구성된다. 각각의 성분에 대하여 다음과 같은 점들을 고 려해야한다. ① 자를 DNA 내에 제한효소로 잘리는 부위가 몇 개가 되는지 파악한다. 같은 양의 DNA에 제한효소 절단부위가 무수히 많을 수도 있고 없을 수도 있으며, 이들 경우에 같은 양의 효소작용을 기대할 수 없을 것이다. 그러나 보통 실험에서는 계산된 양보다 더 .. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 8. 26. 화학공학실험 | DNA 정제 및 분석 TIP 박테리아로부터 염색체 DNA를 분리․정제 하는 과정에서 각 시약과 Enzyme의 작용과 실험과정을 이해하고 PCR과 전기영동법에 대해 알아보며 장치의 조작 방법을 습득한다. Central dogma 유전정보(genetic information)는 DNA에 의해 암호화되어 저장되며, DNA 복제(replication)에 의해 다음 세대로 전달된다. 또한 전사(transcription)의 과정을 통해 DNA에 있던 유전정보는 RNA로 옮겨가고 다시 번역(translation)의 과정을 거치면서 만들어진 단백질(protein)에 의해 유전정보가 실체화되어 몸속에서 기능을 하게 된다. 이처럼 유전정보는 DNA에서 RNA, 단백질로 전환되면서 생명활동을 유지시키는데 필수적인 유전정보의 흐름을 형성하는데 이.. Engineering/화학 공학 | 단위조작 | 유체역학 2020. 6. 7. 생화학실험 | Western Blotting - SDS-Page TIP 1. 단백질을 크기별로 분리하는 기술로 항원-항체 반응을 이용하여 전체 단백질에서 특정 단백질만을 Detection 할 수 있다. 2. 본 Western Blotting은 뉴런으로 분화하기 전인 Neuroblastoma(Ne,신경모세포)를 사용해 신경모세포가 암이 되게 유발하는 단백질을 찾을 수 있다. Gel electrophoresis에 대한 세부적인 이론이 복잡하고 현재로서는 불완전할지라도, 그 기본적인 개념은 쉽게 이해될 수 있다. 간단히 말해서 전기영동 분석은 전하를 띤 입자들이 외부에서 공급된 전기장의 영향을 받아서 반대 부호를 가진 전극 쪽으로 이동하는 데서 기인한다. 입자들의 움직임은 주위의 molecular sieve로서 역할을 하는 gel matrix와의 상호작용에 의해 지연된다... Biology/생화학 2020. 5. 28. 생화학실험 | Western Blot TIP 항원에 대한 항체의 특이적 결합을 이용하여 단백질 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 분석하는 western blot의 원리를 이해하고, 단백질의 SDS-PAGE분리, 단백질의 gel로부터 membrane으로의 transfer, 항체반응 및 항체에 부착된 효소의 반응에 의한 발색반응 등의 실험기법을 습득한다. Immunoblot(western blot)의 원리 immuno blot이라고도 부르는 western blot은 antigen과 antibody사이의 특이적인 결합을 이용하여 시료 속에 위치한 단백질을 정성적/정량적으로 분석하는 방법이다. 단백질이 transfer되어있는 membrane에 원하는 단백질의 antibody를 넣어주면 항원 항체반응을 일으켜 antibody가 원하는 단백질 band에.. Biology/생화학 2020. 5. 26. 화학공학실험 | Electrophoresis - 전기영동 TIP 단백질의 기본적인 개념과 단백질의 분리정제에 대해서 이해하고, 단백질의 분리의 가장 일반적인 방법인 1-D 전기영동 실험을 이용하여 목적하는 단백질의 분리 및 단백질체학(proteomics)의 기본적인 지식을 배양하도록 한다. 실험 방법 1. Casting & Running (Denaturing SDS-PAGE) ① 전기영동 키트의 고유한 방법에 따라 유리판을 casting한다. ② Stacking gel과 running gel 용액을 준비한다. Ⓐ Stacking gel과 running gel 모두 부족할 때를 대비 하여 충분히 만든다 Ⓑ Running gel은 15%, Stacking gel은 5%가 되게 만든다. ③ Running gel 용액에 ammonium persulfate와 TEMED.. Engineering/화학 공학 | 단위조작 | 유체역학 2020. 5. 24. 생화학실험 | Purification of Plasmid DNA TIP Bacteria의 plasmid에 대해 알아보고 DNA의 구조에 의한 추출 원리를 이해한다. Plasmid 세균세포내에서 염색체와 독립적으로 존재하며 증식할 수 있는 환형DNA. 모든 플라스미드는 복제 개시점이 될수 있는 적어도 한 개의 DNA염기서열을 가지며 큰 플라스미드는 자체에 복제 효소를 가지기도 한다. 세균의 생존에 필수적인 유전정보를 가지고 있는 것은 아니지만 플라스미드에서 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자,세균의 자웅을 결정하는 성결정인자등이 발견되고 있다. 제한효소로 고리를 끊은 뒤, 진핵생물의 DNA를 삽입하여 잡종 플라스미드를 만들어도 세균안에서 정상적으로 작동하고 증식하며, 이를 이용한 유전자 재조합을 통해 유용한 단백질을 얻을 수 있다. Vector 필요한 유전자를 잘라내어.. Biology/생화학 2020. 5. 19. 생화학실험 | 형질전환 - 대장균 DNA 전기영동 관찰 형질전환 형질전환(transformation)은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적 성질을 변하게 하는 일을 말한다. 이는 1928년 영국의 그리피스가 Diplococcus pneumonia를 이용하여 실험한 것이 계기가 되어 발견된 실험 방법이다. 세포는 외부의 DNA를 받아들임으로써 원래 갖고 있는 성질과는 다른 새로운 유전형질을 발현할 수 있게 된다. Transformation 에서는 외부의 DNA를 벡터를 이용해 bacteria cell에 주입해 준다. 이러한 벡터를 이용한 외부 DNA를 세포에 주입하는 방법으로는 또한 Transfection이 있다. Transfection은 Transformation과 같이 외부 DNA를 세포에 주입한다는 것은 같지만 가장 큰 차이점으로 Transf.. Biology/생화학 2020. 5. 15. 화공기초실험 | 염색체 DNA의 정제 및 분석 Agarose gel의 전기영동법 단백질이나 핵산 등의 고분자물질은 전하를 띄므로 이를 기초로 하여 이들 분자를 전기장에서 이동 분리시켜 이들의 순도나 성질의 분석 및 분리 등에 사용하는 방법을 전기영동법이라고 한다. 전기영동에서 하전 분자의 이동 방향은 그 분자가 갖는 전하의 부호에 의하여 결정되지만, 전기영동에서 고분자를 움직이는 힘은 전장의 세기(E)이다. 전기영동에 필요한 세가지 성분은 1)전하를 띤 입자, 2)전장, 3)이동이 일어날 수 있는 medium이다. 본 실험에서 DNA분자를 사용했는데 이는 DNA 골격 축에 존재하는 인산 때문에 전기적으로 음전하를 뛰어서 전기장에 놓일 때 양전극을 향해 이동하게 된다. 이때 이동하는 속도는 1)분자의 net electric charge, 2)분자의 크.. Engineering/화학 공학 | 단위조작 | 유체역학 2020. 5. 6. 일반생물학실험 | Southern blotting TIP Rice tissue로부터 genomic DNA를 추출하여 전기 영동한 후 southern blotting한다. probe와 hybridization 하여 특정 DNA의 존재유무와 정량을 알아본다. Southern blot 1975년에 DNA 조각을 전기 영동하여 분리한 후 nitrocell㎕ose filter에 옮겨서 특정DNA 조각을 확인하는 실험 기법이 southern에 의해 개발되었다. Blotting 또는 hybridization이란 한 가닥으로 된 핵산이 이와 상보적인 염기 서열의 또 다른 한 가닥의 핵산과 적당한 조건에서 만나게 되면 이중나선을 형성하는 현상을 말한다. Southern hybridization은 위의 현상을 이용하는 기법으로, 먼저 genomic DNA을 적당한 res.. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 4. 28. 일반생물학실험 | DNA 추출 및 PCR TIP 쥐의 근육세포에서 DNA를 추출하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR) 실험에 이용할 product를 만들고 전기영동으로 그 결과를 확인한다. DNA 복제 DNA가 단백질의 아미노산 배열순서를 결정하는 것은 먼저 DNA 2중나선의 일부분이 풀리고, 풀린 두 외가닥 사슬의 어느 한쪽 사슬에서 전령 RNA(messenger RNA:mRNA)가 만들어진다. 이 mRNA는 DNA와 마찬가지로 염기-펜토오스-인산으로 된 뉴클레오티드의 기다란 연결체인데 펜토오스가 리보오스이며, 염기의 종류가 A,G,C 그리고 U(DNA의 T 대신 U이다)인 점이 다르다. 또 DNA처럼 2중나선이 아니고 외가닥 사슬로만 존재한다. DNA의 한 쪽 가닥 위에서 만들어진 mRNA는 그 염.. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 4. 22. 일반생물학실험 | Agarose gel 만들기 및 DNA electrophoresis TIP 1. 전기영동의 의미를 이해하고 DNA의 크기 및 구조에 따른 결과차이를 이해한다. 2. Agarose gel에 DNA와 loading dye를 넣고 전기를 걸어주면 DNA는 인산기 때문에 매질을 타고 양전하 방향으로 움직이게 된다. 이때 움직이는 속도는 DNA의 크기에 다라 다르므로 매질 내에서 종류에 따라 분리하게 되며 전기영동은 DNA의 크기에 따른 분리를 한다. DNA 전기영동의 원리와 특성 DNA 분자 연구를 위해 겔 전기영동(gel electrophoresis)이 많이 사용된다. 이 기술에서는 겔을 사용하는데, 겔은 크기, 전하량, 기타 물리적 성질에 기초하여 핵산이나 단백질을 분리한다. 핵산은 인산기에 의해 음전하를 띠기 때문에, 전기장 내에서 양극으로 이동한다. 핵산이 전기장 속에서.. Biology/일반 | 세포 생물학 2020. 4. 9. 영양생화학실험 | SDS-PAGE에 의한 단백질 분리와 Western Blotting TIP SDS-PAGE로 단백질을 분리한 후 전기영동을 통해 단백질의 분자량을 측정, 단백질항체이용 분석을 할 수 있다. Western Blot 표적 단백질에 대한 항체를 이용하여 항원-항체 반응으로 그 단백질을 확인하는 방법. 단백질을 비특이적으로 결합하는 nitrocellulose paper의 특성을 이용하여 SDS-PAGE 방법으로 분리된 단백질을 NC종이로 전기이동 시킨 다음 특정 단백질에 대한 항체를 이용하여 그 특정 단백질의 존재 여부, 위치, 양 등을 확인할 수 있다. 먼저 NC종이로 옮겨진 단백질이 더 이상 비특이적으로 결합하지 않게 하기위해서 blocking 한 후 특정 단백질에 대한 항체인 1차 항체를 결합시킨다. 항체에 대한 단백질의 결합은 특이적이므로 강하게 붙어 있는다. 이를 보기.. Engineering/식품 영양 | 공학 2020. 4. 2. 생화학실험 | β-Galactosidase purification & activity & SDS PAGE TIP 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 우리가 얻고자 하는 β-galactosidase를 분리해낸 후 ONPG와 반응시켜 효소의 활성을 확인하고 SDS-PAGE를 이용하여 정제된 β-galactosidase의 밴드 존재유무와 위치를 알아보는 것이었다. 크로마토그래피(Chromatography) 크로마토그래피는 혼합물로부터 그 성분들을 순수하게 분리하거나 확인, 정량하는데 사용하는 편리한 방법 중의 하나이다. 이 방법에 의한 물질의 불리는 혼합물이 정지상(stationary Phase)이나 이동상(mobile phase)에 대한 친화성이 서로 다른 점을 이용하는 것으로, 이 친화성에 중요한 영향을 미치는 인자는 흡착, 이온화 및 분배계수들로써 여러 종류의 크로마토그래피는 이들 인자가 서로 합하여 작용하.. Biology/생화학 2020. 3. 15. 이전 1 2 3 다음 반응형